母豬妊娠期日糧添加甜菜堿對新生仔豬肝臟糖脂代謝的影響及其表遺傳機(jī)制.pdf

1、肝臟是機(jī)體能量代謝的中心，尤其在新生期，是糖、脂、蛋白質(zhì)代謝的主要場所，在機(jī)體代謝平衡過程中起到至關(guān)重要的作用。研究表明，母體妊娠期營養(yǎng)通過表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控新生子代肝臟中各種代謝通路。DNA與蛋白質(zhì)的甲基化反應(yīng)是表觀遺傳學(xué)重要的調(diào)節(jié)機(jī)制之一，甲基供體通過控制甲基化反應(yīng)的程度從而參與表遺傳調(diào)控，暗示其在母體營養(yǎng)程序化過程中的重要功能。甜菜堿是一種重要的甲基供體，作為蛋氨酸代謝的底物，通過蛋氨酸代謝循環(huán)為機(jī)體大部分的甲基化反應(yīng)供應(yīng)甲基基團(tuán)

2、。另外，甜菜堿對動(dòng)物的生長發(fā)育以及糖脂代謝也起到重要的影響，但其機(jī)制仍不清楚。甜菜堿作為甲基供體營養(yǎng)在動(dòng)物妊娠期飼料添加時(shí)對子代糖脂代謝程序化的影響及其潛在的機(jī)制目前尚未報(bào)道。由于新生兒的代謝紊亂常常伴隨著成年期慢性代謝性疾病的發(fā)生，從而危害動(dòng)物的健康;尤其在畜禽業(yè)，不僅影響了畜禽產(chǎn)品的品質(zhì)，而且會(huì)引起畜禽其他疾病的發(fā)生，增加了畜禽的死亡率。因此，本研究的目的是闡述妊娠母豬日糧中甜菜堿的添加對新生仔豬肝臟糖脂代謝的影響，并揭示其表遺傳機(jī)

3、制，為畜禽健康生長以及疾病防治提供重要的理論依據(jù)。
　　1.母豬妊娠期日糧添加甜菜堿對新生仔豬肝臟甜菜堿代謝的影響
　　16頭二胎長·大二元母豬，在其發(fā)情后，用兩頭杜洛克種公豬的混合精液進(jìn)行人工授精;一周后，隨機(jī)分為對照組(Con)和甜菜堿組(Bet)，每組8頭母豬，對照組在母豬整個(gè)妊娠期飼喂基礎(chǔ)日糧，而甜菜堿組在基礎(chǔ)日糧中添加0.3％的甜菜堿。每天三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行飼喂，分別為上午5:00、10:00和下午5:00，自由飲水。

4、妊娠母豬采取自然分娩，對出生仔豬進(jìn)行稱重;分娩結(jié)束后，立即從每窩新生仔豬中選取接近平均體重水平的雄性仔豬1頭，心臟采血后半個(gè)小時(shí)內(nèi)采集血清和肝臟組織，液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱儲(chǔ)存。
　　母豬妊娠期日糧添加甜菜堿顯著升高了新生仔豬血清中甜菜堿（P＜0.05）、蛋氨酸（P＜0.05）以及S腺苷甲硫氨酸(SAM)(P＜0.05)的濃度，血清中SAM∶SAH的比值較對照組仔豬也顯著升高(P＜0.05)。同時(shí)，顯著降低了新生仔豬血清同

5、型半胱氨酸(Hcy)(P＜0.05)的濃度，但對血清中S腺苷同型半胱氨酸(SAH)的濃度沒有顯著影響。此外，甜菜堿組新生仔豬肝臟中甜菜堿、SAM的含量以及SAM∶SAH的比值較對照組仔豬肝臟也顯著升高(P＜0.05)。
　　本實(shí)驗(yàn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot方法檢測肝臟蛋氨酸代謝相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明:甜菜堿仔豬肝臟中甜菜堿高半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(BHMT)、甲硫氨酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶(MAT2B)、甘氨酸N-甲

6、基轉(zhuǎn)移酶(GNMT)和S-腺苷高半胱氨酸水解酶樣因子1(AHCYL1)在翻譯水平均都顯著上調(diào)(P＜0.05)，同時(shí)，BHMT、GNMT和AHCYL1在轉(zhuǎn)錄水平也顯著上調(diào)（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，母豬妊娠期日糧添加甜菜堿增強(qiáng)了新生仔豬肝臟蛋氨酸代謝。
　　2.母豬妊娠期日糧添加甜菜堿對新生仔豬肝臟糖異生的影響
　　母豬妊娠期日糧添加甜菜堿顯著增加新生仔豬肝糖原含量（P＜0.05），同時(shí)，顯著增加血清中生糖氨基酸包括絲氨酸

7、、谷氨酸、蛋氨酸、組氨酸、精氨酸以及乳酸濃度(P＜0.05)以及肝臟中胞質(zhì)型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK1)的酶活(P＜0.05)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot分析，表明甜菜堿組新生仔豬的肝臟糖異生相關(guān)基因如線粒體型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK2)和果糖-1，6-2磷酸果糖酶(FBP1)在基因水平上顯著上升(P＜0.05)，在蛋白水平丙酮酸羧化酶(PC)、PEPCK1、PEPCK2和FBP1的表達(dá)都顯著上

8、調(diào)(P＜0.05)。用甲基化免疫共沉淀(MeDIP)和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)分析表明PEPCK1，PEPCK2和FBP1基因啟動(dòng)子甲基化以及組蛋白修飾的改變(P＜0.05)分別與相對應(yīng)基因的mRNA表達(dá)水平呈反向一致。此外，由于PC和PEPCK1這兩個(gè)基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的不一致，可能是由于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控引起，因此，本實(shí)驗(yàn)對靶向這兩個(gè)基因的miRNAs表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明甜菜堿新生仔豬肝臟中預(yù)測靶向PC的2個(gè)miRNA(mi

9、RNA-184(P＜0.01)和miRNA-196b(P＜0.01））以及預(yù)測靶向PEPCK1的6個(gè)miRNA，miRNA-1403p(P＜0.01), miRNA-424-3p(P＜0.01), miRNA-196b(P＜0.01),miRNA-370(P＜0.01)，miRNA-30b-3p(P＜0.05)和miRNA-92b-5p(P＜0.05)的表達(dá)均被顯著抑制，這與PC和PEPCK1蛋白翻譯升高相一致。結(jié)論:本研究結(jié)果表明母豬

10、妊娠期日糧添加甜菜堿通過表遺傳調(diào)控影響新生仔豬肝臟中的糖異生。
　　3.母豬妊娠期日糧添加甜菜堿對新生仔豬肝臟脂肪酸合成的影響
　　母豬妊娠期日糧添加甜菜堿顯著降低新生仔豬肝臟中甘油三酯含量(P＜0.05)以及脂肪酸合成基因包括乙酰輔酶a羧化酶(ACC)（P＜0.05）、脂肪酸合成酶(FAS)（P＜0.05）、硬脂酰輔酶a去飽和酶(SCD)(P＜0.05)與這些基因的主要調(diào)節(jié)因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1C(SREBP1C)(P

11、＜0.05)的表達(dá)。MeDIP和ChIP分析表明甜菜堿仔豬肝臟中FAS和SCD基因啟動(dòng)子甲基化程度和SCD啟動(dòng)子上H3K27me3的結(jié)合都顯著升高(P＜0.05)，并伴隨著相對應(yīng)的mRNA表達(dá)水平下降。我們預(yù)測SCD基因啟動(dòng)子上有糖皮質(zhì)激素受體(GR)的結(jié)合位點(diǎn)，ChIP分析表明甜菜堿仔豬肝臟GR結(jié)合SCD啟動(dòng)子含量顯著下降(P＜0.05)，而且GR蛋白表達(dá)與血清中皮質(zhì)醇激素水平也顯著下降(P＜0.05)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GR調(diào)節(jié)SCD基

12、因的表達(dá)，我們在肝臟細(xì)胞HepG2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染含有豬SCD啟動(dòng)子基因的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，然后用GR的激動(dòng)劑地塞米松處理細(xì)胞，檢測熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)SCD熒光素酶活性顯著升高(P＜0.05)。然而對SCD啟動(dòng)子上GR結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行缺失突變后，地塞米松升高相應(yīng)的SCD啟動(dòng)子熒光素酶活性顯著下降(P＜0.05)。此外，甜菜堿新生仔豬肝臟中靶向ACC的miRNA-1285和靶向SCD的miRNA-let-7e表達(dá)的改變與相應(yīng)的蛋白水平呈反向一致。

13、以上結(jié)果表明:母豬妊娠期日糧添加甜菜堿通過表遺傳調(diào)控和GR調(diào)節(jié)機(jī)制抑制新生仔豬肝臟脂肪酸合成基因的表達(dá)。
　　4.母豬妊娠期日糧添加甜菜堿對新生仔豬肝臟膽固醇代謝的影響
　　母豬妊娠期日糧添加甜菜堿顯著增加新生仔豬肝臟中的膽固醇含量（P＜0.05），并對膽固醇代謝相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)節(jié)。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2(SREBP2)以及低密度脂蛋白受體(LDLR)在mRNA和蛋白水平均被顯著下調(diào)(P＜0.05)。然而，羥甲基戊二酰輔酶A

14、還原酶(HMGCR)在轉(zhuǎn)錄水平顯著下降(P＜0.05)，但在翻譯水平卻顯著上升（P＜0.05）。另外，膽固醇7α-羥化酶(CYP7a1)的表達(dá)僅在轉(zhuǎn)錄水平被激活（P＜0.05），而膽固醇27α-羥化酶(CYP27a1)的表達(dá)則在mRNA和蛋白水平都顯著上調(diào)(P＜0.05)。用甲基化和染色質(zhì)免疫共沉淀分析表:LDLR和HMGCR基因啟動(dòng)子甲基化水平以及抑制性組蛋白標(biāo)記(H3K27me3)表達(dá)的升高(P＜0.05)與相對應(yīng)的mRNA表達(dá)水平