miR-92a在胃粘膜腸上皮化生中調控CDX2的作用與機制研究.pdf

1、【背景】
　　胃粘膜腸上皮化生是胃癌最常見的癌前病變之一。大多數研究者公認的從慢性萎縮性胃炎,到胃粘膜腸上皮化生,再到非典型增生進而演變?yōu)槲赴┑陌l(fā)展模式中,胃粘膜腸上皮化生是非常重要甚至不可或缺的一環(huán)。然而胃粘膜腸上皮化生的發(fā)生機制目前尚未闡明。膽汁酸刺激是胃粘膜腸上皮化生發(fā)生的一個重要的內源性因素。統計發(fā)現,伴有膽汁反流的病人比不伴有膽汁反流的病人胃粘膜發(fā)生腸上皮化生的風險高11倍。臨床研究表明,反流液中的膽汁酸刺激可能是導致食

2、管腸上皮化生的主要原因。
　　尾側同源盒轉錄因子2(Caudal-related Homeobox2,CDX2)屬于尾側同源盒基因家族的一員,能促進多種腸細胞特異表達基因的轉錄,在維持腸道細胞增殖、發(fā)育、分化等方面發(fā)揮了不可替代的作用。CDX2的顯著激活被認為是胃粘膜腸上皮化生的關鍵因素。研究發(fā)現,與正常胃粘膜相比,腸化生的組織顯著表達原本不表達的CDX2;動物實驗發(fā)現,CDX2轉基因小鼠胃粘膜100％發(fā)生了腸上皮化生。胃粘膜腸上

3、皮化生是胃癌最常見的癌前病變之一。大多數研究者公認的從慢性萎縮性胃炎,到胃粘膜腸上皮化生,再到非典型增生進而演變?yōu)槲赴┑陌l(fā)展模式中,胃粘膜腸上皮化生是非常重要甚至不可或缺的一環(huán)。然而胃粘膜腸上皮化生的發(fā)生機制目前尚未闡明。膽汁酸刺激是胃粘膜腸上皮化生發(fā)生的一個重要的內源性因素。統計發(fā)現,伴有膽汁反流的病人比不伴有膽汁反流的病人胃粘膜發(fā)生腸上皮化生的風險高11倍。臨床研究表明,反流液中的膽汁酸刺激可能是導致食管腸上皮化生的主要原因。

4、>　　尾側同源盒轉錄因子2(Caudal-related Homeobox2,CDX2)屬于尾側同源盒基因家族的一員,能促進多種腸細胞特異表達基因的轉錄,在維持腸道細胞增殖、發(fā)育、分化等方面發(fā)揮了不可替代的作用。CDX2的顯著激活被認為是胃粘膜腸上皮化生的關鍵因素。研究發(fā)現,與正常胃粘膜相比,腸化生的組織顯著表達原本不表達的CDX2;動物實驗發(fā)現,CDX2轉基因小鼠胃粘膜100%發(fā)生了腸上皮化生。然而CDX2在胃粘膜腸上皮化生中表達上調

5、的機制尚未闡明。
　　MicroRNA(miRNA)是真核生物中廣泛存在的一類重要的調控分子,它通過與靶基因信使RNA(mRNA)的3’非編碼區(qū)(3’-UTR)特異性的堿基配對引起mRNA的降解或翻譯抑制,從而發(fā)揮對靶基因的轉錄后沉默作用。miRNA在消化道發(fā)生、發(fā)育、分化及成形過程中發(fā)揮了重要調控作用。那么對于胃粘膜腸上皮化生這樣一種同細胞分化和組織發(fā)育密切相關的病變,miRNA是否也參與其調控呢?
　　我們通過用膽汁酸刺

6、激胃上皮細胞,建立了胃粘膜腸上皮化生的細胞模型;進而用此細胞模型與正常的胃粘膜上皮細胞進行 microRNA微芯片分析,篩選出一批表達差異性顯著的miRNA分子。其中,miR-92a的表達上升最為顯著。隨后,我們建立了miR-92a的功能獲得與缺失模型,并對miR-92a的功能進行了研究,發(fā)現過表達miR-92a后,CDX2在mRNA和蛋白水平上均出現了明顯上調,反之亦然。那么,miR-92a是否參與了胃粘膜腸上皮化生中CDX2的調控?

7、其發(fā)揮作用的靶基因又是什么?本課題將圍繞以上問題展開論述。
　　【目的】
　　1、建立、選優(yōu)與鑒定膽汁酸誘導的胃上皮細胞腸化生模型;2、篩選腸上皮化生的細胞模型與正常的胃粘膜上皮細胞中差異性表達的miRNA分子(即miR-92a);3、建立miR-92a的功能獲得與缺失模型;4、篩選并驗證miR-92a上調CDX2表達的靶基因。
　　【方法】
　　1、選用不同的時間點、采用不同濃度的膽汁酸刺激正常的胃粘膜上皮細胞

8、,用quantitative Real Time-Polymerase Chain Reaction(qRT-PCR)方法檢測相關標志分子的表達,從而選取模型建立的最優(yōu)化的刺激時間和濃度;在此條件下,通過western blot和細胞免疫熒光實驗鑒定膽汁酸誘導的胃上皮細胞腸化生模型。
　　2、采用microRNA微芯片技術,分析比較膽汁酸誘導的胃腸化細胞模型和正常對照細胞,篩選出表達差異顯著的miRNA分子(miR-92a)。

9、r>　　3、利用miR-92a的類似物和抑制物轉染細胞后,采用qRT-PCR和western blot檢測miR-92a對CDX2表達的調控作用。
　　4、聯合多個miRNA靶分子數據庫篩選與miR-92a有潛在結合位點的分子。
　　5、運用熒光素酶報告基因實驗和western blot驗證miR-92a上調CDX2表達的靶基因。
　　【結果】
　　1.成功構建、選優(yōu)與鑒定了膽汁酸誘導胃上皮細胞腸化生模型

10、　　采用四種含有特定濃度的膽汁酸:膽酸(CA),脫氧膽酸(DCA),鵝脫氧膽酸(CDCA)及脫氫膽酸(DHCA)刺激永生化的胃粘膜上皮細胞,在不同的時間節(jié)點(0 h、3h、6 h、9h、12 h、24 h、48h)收獲細胞,qRT-PCR結果顯示,在經膽汁酸刺激后,腸上皮特異分子KLF4、VILLIN及MUC2的mRNA表達均顯著升高,升高倍數為對照組的20至1000倍不等;且升高水平同刺激濃度和時間正相關。在4種膽汁酸刺激模型間橫向比

11、較,CDCA刺激引起腸上皮特異分子升高的倍數明顯高于其他膽汁酸;在同一膽汁酸模型中將不同刺激時間和濃度節(jié)點進行縱向比較,從150μM、第24小時開始,腸上皮特異分子的升高進入平臺期。據此,我們選擇了CDCA刺激24小時作為最終優(yōu)選后的腸化模型進行進一步研究。我們利用Western blot和免疫熒光分別檢測了腸上皮特異分子KLF4、VILLIN及MUC2的表達,發(fā)現這幾種分子在經過CDCA刺激后,蛋白表達均顯著升高。這些結果表明,胃上皮

12、細胞經膽汁酸刺激后,基因型發(fā)生一系列變化,開始表達腸上皮標志分子,可以作為胃粘膜腸上皮化生的細胞模型。
　　2.miR-92a在microRNA微芯片結果中上升最為顯著
　　通過microRNA微芯片分析比較膽汁酸誘導腸化生模型細胞與正常對照細胞,發(fā)現1087種上調的miRNA分子,120種下調的miRNA分子,其中miR-92a的表達水平上升最為顯著。這一結果在CDCA誘導的GES-1和BGC823細胞中得到了驗證。qRT

13、-PCR結果顯示,GES-1和BGC823細胞中miR-92a的表達水平呈時間依賴性上升趨勢,升高倍數為對照組的5至20倍不等。隨后我們在永生化的胃粘膜上皮細胞及多種胃癌細胞系中采用qRT-PCR檢測miR-92a的表達水平,發(fā)現與永生化胃粘膜上皮細胞GES-1相比,AGS、SGC7901和BGC823細胞中miR-92a的表達水平較高;而在MKN45、GC9811和KATDⅢ細胞中表達相對較低,MKN28中表達最低,幾乎檢測不到。

14、r>　　3.miR-92a能夠上調CDX2的表達
　　我們進一步采用miR-92a的類似物mimics和抑制物inhibitor轉染GES-1細胞和BGC823細胞,建立了功能獲得和缺失模型。qRT-PCR檢測發(fā)現,過表達 miR-92a后,CDX2在mRNA水平上的表達呈升高趨勢,其升高程度與miR-92a的上調幅度正相關;CDX2及其下游腸道特異性基因 Sucrose-Isomaltase(S-I)在蛋白水平的表達出現了類似的

15、結果,其表達升高與miR-92a上調水平正相關。抑制miR-92a的表達后出現了相反的結果。上述結果表明,miR-92a可能是通過上調CDX2的表達從而在胃粘膜腸上皮化生中發(fā)揮作用。
　　4.miR-92a通過結合Foxd1的3’-UTR抑制Foxd1的表達
　　為研究miR-92a上調CDX2表達的機制,我們聯合采用miRwalk和miRanda兩個獨立的數據庫,預測出 miR-92a可能的靶基因,將上述兩個數據庫預測到的

16、結果取交集,我們得到了163種miR-92a可能的靶基因。通過進一步功能分析及查閱文獻,我們將研究興趣放在了Forkhead box家族成員轉錄因子Foxd1上。我們隨后采用熒光素酶報告基因實驗證實,miR-92a通過結合Foxd13’-UTR的結合位點,從而影響Foxd1的表達。我們進一步在GES-1細胞中轉染miR-92a的類似物,利用western blot和qRT-PCR方法檢測發(fā)現,miR-92a能夠下調Foxd1蛋白的表達水