丹參酮ⅡA下調(diào)NADPH氧化酶2通路減輕內(nèi)毒素血癥小鼠心功能不全.pdf

1、研究背景：膿毒血癥是機體感染病菌后引起的一種全身反應，嚴重時可以導致膿毒性休克，這是許多國家重癥監(jiān)護病房患者死亡的主要原因之一。膿毒血癥一旦合并有心功能不全，死亡率會明顯增加。革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素(LPS)刺激心肌細胞釋放促炎因子TNF-α，是內(nèi)毒素血癥時心臟抑制的重要原因之一。NADPH氧化酶2(Nox2)依賴性的活性氧(ROS)參與了內(nèi)毒素血癥心功能不全的病理過程。LPS可以引起過度的氧化應激，激活NADPH氧化酶，產(chǎn)生大量ROS，

2、引起下游的ERK1/2、p38MAPK磷酸化及炎癥介質(zhì)釋放，導致內(nèi)毒素血癥心功能不全。因此，抑制炎癥和抗氧化應激可能會預防LPS所致心功能不全。丹參酮ⅡA(TⅡA)是傳統(tǒng)中藥丹參的脂溶性提取物，具有一定的抗炎和抗氧化作用，主要用于臨床缺血性心臟病的治療;研究表明，丹參酮ⅡA具有較強的促進炎癥消退作用，可以誘導中性粒細胞凋亡和促進逆向遷移。丹參酮ⅡA預處理可以提高內(nèi)毒素血癥小鼠存活率，減輕LPS誘導的急性肺損傷。因此，我們推測，丹參酮ⅡA

3、也能夠預防內(nèi)毒素血癥心功能不全。
　　研究目的：(1)體外研究丹參酮ⅡA對LPS刺激心肌細胞釋放TNF-α的抑制作用;(2)體內(nèi)研究丹參酮ⅡA對內(nèi)毒素血癥小鼠心功能和炎癥反應的影響及對Nox2相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)作用。
　　研究方法1.利用原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞，不同濃度丹參酮TⅡA(0-10μM)預處理心肌細胞24 h，然后用LPS(10μg/mL)刺激4h，ELISA檢測細胞上清TNF-α水平。2.采用腹腔注射LPS的方法

4、制作內(nèi)毒素血癥小鼠心功能不全模型。實驗分為四組:(1)對照組(CON group)，腹腔注射同LPS組等體積鹽水;(2)內(nèi)毒素血癥組(LPS group)，腹腔注射LPS10mg/kg誘導內(nèi)毒素血癥;(3)內(nèi)毒素+丹參酮ⅡA組(LPS+ TⅡA group)，腹腔注射TⅡA10mg/kg，每天1次，連續(xù)三天，末次給藥后1h腹腔注射LPS10mg/kg;(4)丹參酮ⅡA組(TⅡA group)，腹腔注射TⅡA10mg/kg，每天1次，連續(xù)

5、三天。分別在LPS注射后6h采用超聲測定小鼠心率(HR)、心輸出量(CO)、射血分數(shù)(EF)和短軸縮短分數(shù)(FS)的變化;ELISA方法檢測心肌TNF-α和IL-β水平;硫代巴比妥酸顯色法和羥胺法分別檢測心肌MDA含量和SOD活性;還原型谷胱甘肽法測定心肌GSH-Px活性;Westernblot檢測iNOS和eNOS表達;LPS注射后1h，采用DCF-DA測定心肌ROS水平;Westernblot測定心肌Nox2蛋白以及ERK1/2、p

6、38MAPK磷酸化水平。3.生存分析:腹腔注射TⅡA10mg/kg連續(xù)三天，末次注射后1h，腹腔注射LPS20mg/kg，間隔12小時記錄小鼠死亡情況，記錄5天生存率，描繪Kaplan-Meier生存曲線。
　　結(jié)果：1.丹參酮ⅡA對細胞活力無影響;LPS(10μg/mL，4 h)增加TNF-α分泌(164.0±1.73pg/mL)，丹參酮ⅡA呈劑量依賴性地抑制LPS誘導的TNF-α分泌。
　　2.當觀察期結(jié)束時，LPS組存

7、活2只，生存率為13.3％;而丹參酮ⅡA預處理組的小鼠存活8只，生存率為53.3％。生存分析結(jié)果顯示，與LPS組比較，丹參酮ⅡA預處理使小鼠生存率提高了40％。
　　3.LPS注射后6h，LPS組小鼠心臟收縮功能明顯下降，與CON組小鼠相比，LPS組小鼠EF、FS、SV、CO分別下降48.3％、41.3％、58.16％和66.1％;與LPS組小鼠相比，丹參酮ⅡA預處理組EF、FS、SV、CO分別提高了42.3％、30.1％、60.

8、94％和77.6％(P＜0.05)。
　　4.LPS注射后6h，小鼠心肌組織TNF-α和IL-β水平都顯著升高，丹參酮ⅡA預處理顯著降低心肌TNF-α和IL-β水平(P＜0.05)。
　　5.LPS注射后6h，小鼠心肌組織MDA含量較CON組明顯升高，SOD和GSH-Px活性顯著降低(P＜0.05);但與LPS組相比，丹參酮ⅡA預處理使MDA升高水平減少了20.9％，SOD增加了78.3％(P＜0.05)，GSH-Px有升高

9、趨勢，但差異不顯著(P＞0.05)。
　　6.LPS注射后6h，小鼠心肌組織中iNOS表達量顯著增高，而eNOS表達水平明顯下降了47.3％;丹參酮ⅡA預處理使iNOS表達量減少39.6％，而eNOS表達水平增高65％(P＜0.05)。
　　7.LPS注射后1h，心肌組織中Nox2表達和ROS生成增加，磷酸化ERK1/2和p38MAPK水平明顯升高;丹參酮ⅡA預處理可以顯著下調(diào)Nox2、ROS和ERK1/2、p38MAPK磷