基于限制性核酸內(nèi)切酶放大技術(shù)的沙門(mén)氏菌檢測(cè)生物傳感器.pdf

1、本文詳細(xì)介紹了食源性致病菌的危害、常見(jiàn)種類及研究現(xiàn)狀。核酸適配體的功能及其特點(diǎn)和應(yīng)用。限制性核酸內(nèi)切酶放大技術(shù)的特點(diǎn)及其在生物傳感器檢測(cè)中的應(yīng)用。并對(duì)核酸適配體生物傳感器做了相關(guān)改進(jìn)，用于檢測(cè)食源性致病菌。
　　1、我們通過(guò)適配體的特異性識(shí)別和吸附功能設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)便、省時(shí)、一步檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的熒光生物傳感器。該方案主要基于鏈置換放大-聚合酶延伸對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行靈敏檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)巧妙設(shè)計(jì)了一個(gè)拱形探針（由aptamer和primer構(gòu)成）和

2、一個(gè)發(fā)夾探針（HP）。發(fā)夾的3’端和5’端分別修飾了熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)。只有當(dāng)目標(biāo)物沙門(mén)氏鼠傷寒菌存在的條件下，才能夠破壞拱形探針，釋放 primer鏈。被釋放的 primer鏈打開(kāi)發(fā)夾探針，使猝滅基團(tuán)和熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離，產(chǎn)生熒光。同時(shí)在聚合酶的延伸作用下，發(fā)生連置換反應(yīng)，使primer鏈能夠重復(fù)利用，達(dá)到信號(hào)放大的目的。因?yàn)樾盘?hào)放大和熒光強(qiáng)度檢測(cè)的本質(zhì)上的高靈敏性，600 cfu mL-1的致病菌可以在2 h內(nèi)得到檢測(cè)，這樣比之前報(bào)道的檢

3、測(cè)方法更加的敏感和有效。因此它為發(fā)展鏈置換放大效應(yīng)基于超靈熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)致病菌的發(fā)展和食品安全分析提供了良好的應(yīng)用平臺(tái)。
　　2、在這項(xiàng)工作中，基于目標(biāo)物誘導(dǎo)的指數(shù)放大反應(yīng)，我們發(fā)明了一種簡(jiǎn)單、迅速、等溫、和超靈敏的均勻比色適配體傳感器來(lái)對(duì)致病菌進(jìn)行探測(cè)。這種適配體-引物探針包括結(jié)合鼠傷寒沙門(mén)氏菌的適配體和一段引物序列，這種發(fā)夾探針包括一個(gè)引物單元，這個(gè)適配體-引物探針被用于識(shí)別目標(biāo)物并且通過(guò)基于目標(biāo)物而激發(fā)指數(shù)放大反應(yīng)（EXPA

4、R）。由于EXPAR耦合DNA酶的放大策略，在目標(biāo)物致病菌出現(xiàn)的時(shí)候，將會(huì)在溶液中形成大量大 G-四聯(lián)體低聚物，然后在鉀離子和血紅素的輔助下，又折疊成為 G-四聯(lián)體/血紅素復(fù)合物，這種復(fù)合物對(duì)于過(guò)氧化氫有很強(qiáng)的催化活性，并且產(chǎn)生很強(qiáng)的紫外吸收。這種新穎的EXPAR耦合模仿過(guò)氧化酶催化放大技術(shù)通過(guò)比色法來(lái)探測(cè)致病菌。在最佳條件下，這種生物傳感器對(duì)于致病菌的檢測(cè)是非常靈敏的，在4h之內(nèi)它的檢測(cè)限度是80 cfu mL-1.同時(shí)，我們的生物傳