乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離鑒定及槐耳清膏抑制其產(chǎn)生的作用和機(jī)制.pdf

1、侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特征，是導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)和患者死亡的重要原因。乳腺癌是威脅全球女性健康的惡性腫瘤之一，早期即可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，循環(huán)腫瘤細(xì)胞被認(rèn)為是血行轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，它對(duì)指導(dǎo)臨床制定治療方案、監(jiān)測(cè)治療效果、提示乳腺癌的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、以及評(píng)估患者預(yù)后情況都有重要意義。
　　循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究正在深入，愈來愈多的目光集中到臨床應(yīng)用方面，而對(duì)于各種治療能否降低循環(huán)腫瘤細(xì)胞仍有爭(zhēng)議。因此，我們開展一項(xiàng)meta分析，整理了已經(jīng)發(fā)表的在

2、治療前后檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的研究論文，并評(píng)估現(xiàn)有的抗腫瘤治療對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的影響。結(jié)論是肯定的，但要將其應(yīng)用于臨床實(shí)踐還需更多更深入的研究。
　　至今，化療仍然是乳腺癌治療的基本手段之一，一線藥物紫杉類、蒽環(huán)類和抗代謝類等化療藥物的使用，盡管可以在很大程度上改善患者預(yù)后，但其毒副反應(yīng)也不容忽視。隨著傳統(tǒng)中藥開發(fā)新藥治療癌癥成為新的研究方向。越來越多的報(bào)道證實(shí)槐耳清膏具有抗腫瘤作用，是有效的乳腺癌臨床輔助治療藥物。然而，槐耳清膏的抗腫

3、瘤作用機(jī)制尚不完全明了，尤其對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的形成的影響尚不清楚。有研究表明上皮細(xì)胞間質(zhì)化(EMT)與循環(huán)腫瘤細(xì)胞間存在密切的聯(lián)系，而且循環(huán)腫瘤細(xì)胞本身也會(huì)表達(dá)EMT的相關(guān)標(biāo)志物。因此我們提出假設(shè):槐耳清膏可能調(diào)節(jié)EMT影響循環(huán)腫瘤細(xì)胞的形成，從而降低乳腺癌的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。由于商品化的儀器，比如Cellsearch(@)更側(cè)重于臨床，主要用于預(yù)后監(jiān)測(cè)等方面，不能夠分離活細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。基于此，我們建立適合本科室檢測(cè)乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法對(duì)

4、32例臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)用，然后在小鼠乳腺癌原位移植瘤模型上探討槐耳清膏抑制乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的作用與機(jī)制。
　　其主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1.循環(huán)腫瘤細(xì)胞反映抗腫瘤治療效果的meta分析。
　　(1)通過隨機(jī)效應(yīng)模型分析治療前后循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性率，總體分析顯示:與治療前相比，治療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性率顯著下降(RR=0.68，95％ CI:0.61 to0.76，P＜0.00001; I2=73％, P＜0.

5、00001)。
　　(2)亞組分析顯示不同治療手段對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性率的影響不盡相同。新輔助化療、化療和聯(lián)合治療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性率顯著下降:新輔助化療(RR=0.65，95％CI:0.52 to0.81,P=0.0001; I2=32％,P=0.16)，化療(RR=0.81,95％ CI:0.69 to0.95,P=0.009; I2=72％，P＜0.0001)和聯(lián)合治療(RR=0.64，95％ CI:0.54 to0.75，

6、P＜0.0001;I2=67％，P＜0.0001)，而手術(shù)亞組治療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性率未顯著降低(RR=1.40，95％CI:0.56 to3.50, P=0.47; I2=45％, P=0.16)。
　　(3)亞組分析顯示乳腺癌不同分子分型對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性率有影響:與治療前相比，HER2陽性患者和HER2陰性患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性率顯著下降:HER2陽性患者(RR=0.68，95％ CI:0.57 to0.82, P＜0.00

7、01; I2=0％，P=0.59)和HER2陰性患者(RR=0.52，95％ CI:0.31 to0.86，P=0.01; I2=66％，P=0.01)，但是三陰性患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性率沒有變化(RR=0.38，95％ CI:0.06 to2.33，P=0.29; I2=72％，P=0.06)。
　　(4)循環(huán)腫瘤細(xì)胞狀態(tài)與患者預(yù)后間關(guān)系的亞組分析顯示:與治療后循環(huán)腫瘤細(xì)胞上升或者持平的患者相比，循環(huán)腫瘤細(xì)胞下降的患者有更長(zhǎng)的總

8、生存期（均值差=11.61月，95％ CI:8.63 to14.59，P＜0.00001; I2=69％，P=0.07）;其疾病進(jìn)展概率更低（OR=0.54，95％ CI:0.33 to0.89，P=0.01; I2=45％，P=0.05），無進(jìn)展生存期更長(zhǎng)(均值差=5.07月，95％ CI:2.70 to7.44, P＜0.0001; I2=96％, P＜0.00001)。
　　2.乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法的建立及在臨床樣本中

9、的初步應(yīng)用
　　(1)通過組合密度梯度離心、免疫磁珠分離和流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)，建立起乳腺癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的分離方法。免疫熒光用于鑒定分離的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。結(jié)果表明所建立的分離方法能有效地從乳腺癌患者外周血分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞，鑒定結(jié)果顯示，乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞是Epcam陽性、CK18陽性、CD45陰性的有核細(xì)胞，其細(xì)胞直徑較大，核漿比例較高，符合目前對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的定義。雖然該測(cè)定方法以人工操作為主，但較商品化的儀器Cellsear

10、ch(@)等能夠提供更多信息，有利于對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行更深入的基礎(chǔ)和臨床研究。
　　(2)對(duì)32例乳腺癌患者外周血進(jìn)行了循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)，27例能檢出循環(huán)腫瘤細(xì)胞（≥1 CTC/7.5mL），占比為84.4％，而作為對(duì)照組的纖維腺瘤患者、健康自愿者中的血液均為陰性。在32例患者中，10例轉(zhuǎn)移患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性且≥5 CTCs/7.5mL檢出率為80％，而無轉(zhuǎn)移患者的陽性且≥5 CTCs/7.5mL檢出率僅為22.7％，P=0.

11、002。Ki67陽性患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性且≥5 CTCs/7.5mL檢出率50％，高于Ki67陰性患者的循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性且≥5 CTCs/7.5mL檢出率(12.5％)，P=0.061。上述結(jié)果顯示，我們建立的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法穩(wěn)定性和可靠性好，能夠較好的反映乳腺癌的進(jìn)展。
　　3.槐耳清膏抑制乳腺癌移植瘤的EMT表型，繼而抑制其循環(huán)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的作用和機(jī)制
　　(1)構(gòu)建帶綠色熒光的GFP-4T1細(xì)胞系，然后建立BAL

12、B/c小鼠乳腺癌原位移植瘤模型，再通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中綠色熒光細(xì)胞的數(shù)量而反映乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞狀態(tài)。通常在建模第12天即可從外周血中檢測(cè)到綠色熒光細(xì)胞，表明模型建立成功。
　　(2)建模第二周末開始藥物干預(yù)，通過流式細(xì)胞儀動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血液中GFP-4T1細(xì)胞變化，每周1次，共4次，以反映乳腺癌荷瘤小鼠外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的狀態(tài)。第一周各組間循環(huán)腫瘤細(xì)胞未見顯著差異。而在第2、3和4周，槐耳清膏給藥組(50mg和100mg)檢出的

13、循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量顯著少于對(duì)照組（P值均小于0.01），而多西他賽組則無顯著差異。這些結(jié)果表明槐耳清膏較多西他賽能更有效地抑制循環(huán)腫瘤細(xì)胞的形成。
　　(3)槐耳清膏能減少轉(zhuǎn)移灶的形成，在對(duì)照組中有22處轉(zhuǎn)移灶，而槐耳清膏100mg組只有13處，P＜0.05;而多西他賽組與對(duì)照組無顯著差異，P＞0.05。通過調(diào)控移植瘤EMT表型，繼而減少循環(huán)腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生，P＜0.05。
　　(4)槐耳清膏處理后，顯著增高E-cadherin

14、表達(dá)而降低N-cadherin表達(dá)，與降低循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量及減少轉(zhuǎn)移灶形成相一致，提示槐耳清膏能通過調(diào)控移植瘤的EMT表型降低循環(huán)腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生進(jìn)而減少轉(zhuǎn)移的發(fā)生。
　　(5)相較于對(duì)照組，槐耳清膏和多西他賽處理均能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)（P值均小于0.05）?；倍甯嗄軌蛱岣咝∈蟮纳媛是覍?duì)體重與白細(xì)胞無明顯影響，而多西他賽則相反。
　　綜上所述，循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以作為監(jiān)測(cè)乳腺癌治療效果、乳腺癌患者預(yù)后的指標(biāo)，同時(shí)也能夠輔助