吲哚美辛提高脂肪移植保留率的實(shí)驗(yàn)研究及相關(guān)機(jī)制探討.pdf

1、目的：
　　脂肪移植近年來作為軟組織修復(fù)重建的新興技術(shù)一直被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，如燒傷后的繼發(fā)畸形、慢性創(chuàng)面、創(chuàng)傷、放射性損傷以及腫瘤切除術(shù)后的繼發(fā)缺損。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，盡管外科技術(shù)水平不斷提高，尤其是BRAVA的出現(xiàn)和預(yù)處理脂肪移植受區(qū)使移植效果大大提高，脂肪移植技術(shù)仍面臨著供區(qū)不足以及移植最終保留率的不可預(yù)測(cè)性的難題。大膽假設(shè)添加吲哚美欣一方面可通過上調(diào)PPAR-γ的表達(dá)啟動(dòng)成脂過程，另一方面，通過調(diào)控炎癥反應(yīng)強(qiáng)度保護(hù)移植

2、組織中的脂肪前體細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)原本存在的ASC在成脂環(huán)境下進(jìn)入成脂分化過程。為驗(yàn)證該假說，本實(shí)驗(yàn)組采取兩項(xiàng)獨(dú)立補(bǔ)充性實(shí)驗(yàn)來探討吲哚美欣的促成脂效應(yīng)。首先，為了檢測(cè)吲哚美欣促成脂效應(yīng)的最適宜濃度，本實(shí)驗(yàn)組將各個(gè)濃度梯度的吲哚美欣與條件培養(yǎng)基混合培養(yǎng)ASC并觀察最佳成脂分化組，同時(shí)檢測(cè)各添加組及對(duì)照組成脂基因表達(dá)情況以此獲得最適宜濃度。另外，建立小鼠的脂肪移植模型觀察體內(nèi)情況下各組的最終保留率。盡管吲哚美辛早已被FDA批準(zhǔn)適用于臨床的多個(gè)方

3、面，但作為藥物性添加劑應(yīng)用于脂肪移植領(lǐng)域以及作為培養(yǎng)基添加劑培養(yǎng)人類ASC卻從未有此類研究報(bào)道，因而本實(shí)驗(yàn)作為前瞻性實(shí)驗(yàn)對(duì)于簡化脂肪移植流程和提高最終移植效果具有積極的探索性意義。
　　方法：
　　1、人條件培養(yǎng)基及Zuk培養(yǎng)基的準(zhǔn)備
　　本次實(shí)驗(yàn)研究使用患者腹部脂肪抽吸術(shù)后的廢棄游離脂肪，新鮮獲取的脂肪抽吸物用PBS清洗數(shù)次以洗去多余油滴和其他液體，然后以1∶3的比例置于完全培養(yǎng)基（DMEM、10％胎牛血清、1％盤尼

4、西林-鏈霉素、1％葡萄糖）內(nèi)，在37℃、5％二氧化碳和95％的濕度條件下培養(yǎng)24h。將孵育培養(yǎng)過后的培養(yǎng)基過濾以移除多余殘?jiān)?。將此過濾后的條件培養(yǎng)基分裝后放入-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩Ｐ柚苽浯俪芍饔玫腪uk培養(yǎng)基作為陽性對(duì)照。按文獻(xiàn)所得，將DMEM，10％胎牛血清，0.5mM異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)，1μM地塞米松，10μM胰島素，200μM吲哚美辛，and1％抗生素混合即為Zuk成脂培養(yǎng)基。同樣過濾后分裝、凍存?zhèn)溆谩?br>　　2、

5、人ASCs的分離提取和培養(yǎng)
　　使用患者脂肪抽吸術(shù)后獲得的廢棄脂肪組織，將之充分剪碎后，用0.1％的Ⅰ型膠原酶消化50min，期間充分震蕩使脂肪組織與膠原酶充分接觸。然后300g離心5min，棄上清液，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，用100μm的尼龍網(wǎng)過濾后再以700g離心5min。棄上清液，用PBS徹底洗滌離心后的細(xì)胞，再次用完全培養(yǎng)基重懸后，分裝至培養(yǎng)皿培養(yǎng)。于次日更換新鮮培養(yǎng)液，將已貼壁90％的ASCs消化下來后，分裝并凍存于液氮

6、以備隨時(shí)使用。
　　3、吲哚美欣最佳濃度測(cè)定的體外實(shí)驗(yàn)
　　健康的人ASCs以2.0×104/孔接種至24孔板中，在完全培養(yǎng)基下培養(yǎng)至80％細(xì)胞聚集后，于第二日更換不同的條件培養(yǎng)液，依次更換為完全培養(yǎng)基（陰性對(duì)照）、Zuk培養(yǎng)基（陽性對(duì)照）和實(shí)驗(yàn)組中的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在實(shí)驗(yàn)處理組中，以遞增濃度梯度的形式將吲哚美辛添加至上述已配置完好的條件培養(yǎng)液中，形成50，100，150，and200μM濃度的富含吲哚美辛的條件培養(yǎng)液，以確

7、定吲哚美辛促成脂作用的最適宜濃度。同時(shí)，制備Zuk培養(yǎng)液與200μM吲哚美辛的混合培養(yǎng)液，使吲哚美辛達(dá)到400μM的更高濃度。連續(xù)培養(yǎng)2周，每3天換一次培養(yǎng)基。所有分組為:完全培養(yǎng)基(Cm)、Zuk、條件培養(yǎng)基(Cd+50μM indo;Cd+100μM indo;Cd+150μM indo;Cd+200μM indo;Zuk+200μM indo)。4、油紅O染色及定量分析
　　為檢驗(yàn)ASC的分化程度，ASCs培養(yǎng)2周后進(jìn)行油紅

8、O染色鑒定。10％的福爾馬林液固定細(xì)胞，充分固定后洗滌，然后以油紅O溶液（稀釋于60％異丙醇溶液）染色1h后PBS多次清洗，然后加入1ml/孔的蘇木精染色液染色5min。移除蘇木精染液后，每孔加入1ml新鮮蒸餾水并至于光鏡下觀察拍照。為了將攝入油紅O染料的脂滴提取出來，每孔加入1ml異丙醇溶液，室溫下溫和震蕩15min，期間更換3次異丙醇溶液，最后每孔取250u L液體依次加入96孔板中，將96孔板置入分光儀中，取OD值為492nm進(jìn)行

9、半定量分析測(cè)定。
　　5、RT-PCR定量分析
　　提取不同實(shí)驗(yàn)組(Cm、Cd、Zuk、Cd+50μM indo;Cd+100μM indo;Cd+150μMindo;Cd+200μM indo;Zuk+200μM indo)中ASCs的RNA。根據(jù)引物原則，測(cè)定成脂基因PPAR-γ、CEBP-α、CEBP-β、FABP4、LPL等，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換以2-ΔΔCT相對(duì)表達(dá)量顯示，內(nèi)參基因設(shè)為18S。
　　結(jié)果：
　　1、

10、吲哚美辛以劑量遞增的方式促進(jìn)ASCs向成熟脂肪細(xì)胞分化
　　本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的吲哚美辛均可促進(jìn)hASC的成脂化過程。油紅O染色用以鑒別成熟脂肪細(xì)胞的分化程度。觀察發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后7天細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，加入不同濃度吲哚美欣培養(yǎng)液誘導(dǎo)成脂時(shí)可在72h內(nèi)觀察到脂滴聚集?？傮w而言，經(jīng)過2周遞增濃度梯度成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后細(xì)胞的分化成熟程度也表現(xiàn)出劑量遞增模式，并且添加200μMindo誘導(dǎo)成脂培養(yǎng)基組脂滴最多，大致觀察與Zuk誘導(dǎo)成脂組

11、無異。然而，在Zuk+200μM indo(400μM indo)組富含脂滴的成熟脂肪細(xì)胞的數(shù)量并不出現(xiàn)持續(xù)性的增高。這一現(xiàn)象與半定量分析油紅O溶液吸收率的結(jié)果一致。
　　2、吲哚美辛在脂肪來源的條件培養(yǎng)基中上調(diào)成脂基因的表達(dá)
　　200μM吲哚美辛聯(lián)合脂肪來源的條件培養(yǎng)基可有效誘導(dǎo)成脂化過程，培養(yǎng)后7天成脂基因PPAR-γ，CEBP-α，F(xiàn)ABP4，LPL的表達(dá)顯著抬高，這一時(shí)期僅CEBP-β的表達(dá)并未出現(xiàn)明顯上抬，可能原

12、因是CEBP-β的表達(dá)量上升出現(xiàn)于成脂化的較晚時(shí)期而非早期。其中，PPAR-γ的表達(dá)在吲哚美欣+脂肪來源的條件培養(yǎng)基組與Zuk培養(yǎng)組有同等程度的升高，這兩組表達(dá)量明顯高于陰性對(duì)照組和單獨(dú)添加吲哚美辛組，并與Zuk組無顯著性差異?？傮w而言，吲哚美欣在脂肪來源的條件培養(yǎng)基的存在下的所有基因表達(dá)均顯著提高，而單獨(dú)應(yīng)用該藥物或單獨(dú)使用脂肪來源的條件培養(yǎng)基并不出現(xiàn)成脂基因明顯上臺(tái)表現(xiàn)，提示吲哚美欣的促成脂效應(yīng)只有在成脂微環(huán)境下才能得到最大化。

13、r>　　3、移植組織的大體觀察和體積測(cè)量
　　移植物在移植早期（2周和4周）出現(xiàn)了良好的包裹和血管化。SVF輔助脂肪移植組和吲哚美辛輔助脂肪移植組在所有時(shí)間點(diǎn)與單獨(dú)脂肪移植組相比體積均明顯增大。12周時(shí)計(jì)算移植體積終保留率，吲哚美辛處理組（不加SVF/加SVF）的體積終保留率顯著增加，分別為28.8％和35.76％，對(duì)照組為14.9％。吲哚美欣輔助脂肪移植組與SVF輔助脂肪移植組的體積終保留率無顯著差異。
　　4、吲哚美欣促

14、進(jìn)移植脂肪細(xì)胞的活性但對(duì)血管化無影響
　　通過圍脂滴蛋白鑒定脂肪細(xì)胞的活性?？梢杂^察到，4周時(shí)，吲哚美欣處理組活性脂肪細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)上具有更好的組織結(jié)構(gòu)的完整性?；钚灾炯?xì)胞的百分比分別為吲哚美欣處理組（62％±1.4％）、單獨(dú)脂肪移植組（對(duì)照組）(44％±2.3％)(p=0.016)，提示吲哚美欣可幫助延遲脂肪細(xì)胞的死亡或增強(qiáng)ASC的生存能力，這些都可促進(jìn)移植晚期的成脂化過程。然而值得注意的是，吲哚美欣單獨(dú)處理組（62％±1.

15、4％）與SVF輔助移植組（60.9％±1.9％）(p=0.138)在脂肪體積百分比上未見明顯不同。同樣，CD31染色在各組之間也未見明顯差異(p=0.290)。上述所有數(shù)據(jù)均由組織形態(tài)學(xué)分析定量計(jì)數(shù)4周時(shí)圍脂滴蛋白和CD31的陽性比率所得，該時(shí)間點(diǎn)由Kato等日本學(xué)者認(rèn)為是脂肪再生發(fā)生的最有效階段，其研究亦觀察到圍脂滴蛋白陽性細(xì)胞在該時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)峰值。
　　5、吲哚美欣處理后可提高脂肪再生的能力
　　本實(shí)驗(yàn)中意外發(fā)現(xiàn)了在移植組

16、織中的間質(zhì)纖維組織和空泡周圍出現(xiàn)了一些小而圓的單房或多房細(xì)胞，其直徑一般小于30μm并強(qiáng)烈表達(dá)圍脂滴蛋白，這揭示了移植后的成脂化現(xiàn)象，且對(duì)照組和吲哚美欣處理組均在4周時(shí)達(dá)到峰值。另有研究將直徑小于30μm的小脂肪細(xì)胞定義為新生的脂肪細(xì)胞，而在我們的研究中，這一現(xiàn)象通常在2周和4周是可以觀察到，與此同時(shí)在對(duì)照組中卻極少觀察到此類小脂肪細(xì)胞的存在。正因?yàn)樵擃惣?xì)胞具有脂肪新生的提示性意義，對(duì)此類細(xì)胞進(jìn)行量化，結(jié)果顯示，代表著新生脂肪細(xì)胞的小脂