與膜聯(lián)蛋白A7相互作用蛋白以及細(xì)胞自噬和凋亡誘導(dǎo)劑的篩選、鑒定及其作用機(jī)制研究.pdf

1、自噬是細(xì)胞內(nèi)組分包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、核苷酸、細(xì)胞器及入侵的病原體被運(yùn)送到溶酶體降解的過程。降解產(chǎn)物可以被細(xì)胞重新用于營養(yǎng)循環(huán)或細(xì)胞器更新，因此自噬對于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和能量代謝平衡非常重要。自噬可被多種因素誘導(dǎo)，例如營養(yǎng)或生長因子缺乏、低氧、活性氧、DNA損傷、受損細(xì)胞器及病原體入侵等，此時(shí)，自噬主要起保護(hù)性的作用使機(jī)體適應(yīng)環(huán)境變化。自噬失調(diào)會導(dǎo)致重大疾病發(fā)生，包括心血管疾病、神經(jīng)退行性病變、腫瘤、動脈粥樣硬化和老化等。因此，研究自噬

2、的分子機(jī)制具有極為重要的病理、生理學(xué)意義。
　　 血管內(nèi)皮細(xì)胞是覆蓋于血管內(nèi)膜表面的單層細(xì)胞，在保護(hù)內(nèi)膜完整性及維持血液流動和穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵的作用。內(nèi)皮功能的失調(diào)會引發(fā)多種疾病如高血壓、動脈硬化、高血糖癥等。自噬和血管內(nèi)皮功能的失調(diào)都會導(dǎo)致疾病。因此，近年來自噬的功能以及自噬對正常內(nèi)皮細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)成為研究熱點(diǎn)。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)化學(xué)小分子ABO可以誘導(dǎo)正常培養(yǎng)條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬，并可以抑制去血清去生長因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)

3、胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A7(ANXA7，Annexin A7，synexin)通過對鈣離子的調(diào)控在ABO誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞自噬中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。ANXA7是鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白－Annexins家族成員之一，具有形成鈣離子通道及調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的功能。并且我們的前期數(shù)據(jù)表明ANXA7介導(dǎo)的細(xì)胞自噬信號通路與經(jīng)典的mTOR、ROS介導(dǎo)的信號通路不同，表明ANXA7介導(dǎo)著新的細(xì)胞自噬信號通路，但是其下游因子尚未知。
　　

4、ANXA7在誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中發(fā)揮重要的作用，然而其調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的自噬機(jī)理尚不清楚。為此，本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選和鑒定了與ANXA7相互作用的蛋白，并研究其相互作用與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬之間的關(guān)系，這為闡明血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　 具有調(diào)節(jié)細(xì)胞或蛋白功能及生物學(xué)過程的化學(xué)小分子是研究細(xì)胞信號通路和疾病機(jī)理的良好工具，同時(shí)可為開發(fā)治療相關(guān)疾病的藥物奠定基礎(chǔ)。另外，細(xì)胞自噬和凋亡之間關(guān)聯(lián)密切，但是其關(guān)

5、聯(lián)機(jī)制仍未知。因此，本研究第二部分內(nèi)容為篩選和鑒定能夠調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞自噬與凋亡的化學(xué)小分子，目的是為深入研究肺癌細(xì)胞自噬和凋亡及其關(guān)聯(lián)的復(fù)雜機(jī)理提供新的工具和切入點(diǎn)，同時(shí)為開發(fā)新的治療肺癌的藥物提供新先導(dǎo)化合物。
　　 研究內(nèi)容：
　　 1.利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選并鑒定與ANXA7相互作用的蛋白
　　 (1)構(gòu)建誘餌蛋白表達(dá)載體NpGBKT7－ANXA7
　　 (2)檢測誘餌蛋白對酵母細(xì)胞AH109的毒性及

6、自激活效應(yīng)
　　 (3)篩選人肝臟cDNA文庫
　　 (4)生物信息學(xué)分析陽性文庫質(zhì)粒，并在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證候選蛋白與ANXA7的相互作用
　　 2.篩選出與ANXA7相互作用的粒鈣蛋白，并研究其在化學(xué)小分子ABO誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的調(diào)控作用。
　　 (1)ABO對粒鈣蛋白和ANXA7相互作用的影響
　　 (2)ABO對粒鈣蛋白在血管內(nèi)皮細(xì)胞分布的影響
　　 (3)抑制粒鈣蛋白的表達(dá)

7、對ABO誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的影響
　　 (4)粒鈣蛋白和ANXA7的相互作用對血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子的影響
　　 3.利用肺癌細(xì)胞篩選能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬與凋亡的化學(xué)小分子，為研究自噬或凋亡的細(xì)胞信號通路提供工具，為開發(fā)相關(guān)治療疾病的藥物奠定基礎(chǔ)。
　　 (1)小分子化合物對P53野生型A549細(xì)胞生長及作用機(jī)制研究
　　 (2)小分子化合物對P53突變型H322細(xì)胞生長及作用機(jī)制研究
　　 (3)小

8、分子化合物對P53缺失型H1299細(xì)胞生長及作用機(jī)制研究
　　 (4)小分子化合物對正常胚肺細(xì)胞生長作用的影響
　　 研究方法：
　　 Ⅰ.利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選鑒定與ANXA7相互作用的蛋白并研究其在血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的作用
　　 1.誘餌表達(dá)載體NpGBKT7-ANXA7構(gòu)建：以pCMV6-XL5－ANXA7質(zhì)粒為擴(kuò)增ANXA7基因序列的模板，使用引物ANXA7-F/R引入特異性的酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物

9、雙酶切后連接入酵母表達(dá)載體NpGBKT7中。
　　 2.檢測誘餌蛋白對酵母細(xì)胞的毒性和自激活效應(yīng)：根據(jù)Clontech公司操作手冊，將誘餌質(zhì)粒NpGBKT7－ANXA7和空載體NpGBKT7分別轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109，根據(jù)轉(zhuǎn)化兩種質(zhì)粒的酵母在固體SD/-Trp缺陷培養(yǎng)基的生長表型，以及在液體SD/-Trp缺陷培養(yǎng)基中的菌體密度判斷誘餌蛋白對酵母細(xì)胞的毒性。將NpGBKT7-ANXA7和pGADT7快速共轉(zhuǎn)入酵母AH109，

10、通過酵母在不同3－AT濃度的SD/-Trp/-Leu/-His平板上的長勢判斷誘餌蛋白有無自激活效應(yīng)。
　　 3.篩選cDNA文庫：根據(jù)操作手冊將人肝臟cDNA文庫轉(zhuǎn)化攜帶誘餌質(zhì)粒的酵母感受態(tài)細(xì)胞，取100μl梯度稀釋的細(xì)胞懸液，分別涂布于φ9cmSD/-Trp/-Leu板上計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，剩余酵母菌液涂在含2.5 mM3－AT的SD-Trp/-Leu/-Hisφ15 cm平皿內(nèi)初步篩選陽性克隆。
　　 4.Cos7細(xì)胞培

11、養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：Cos7細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100 Units/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照Invitrogen公司轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000的使用手冊操作。
　　 5.候選蛋白與ANXA7相互作用的鑒定：免疫共沉淀和免疫熒光共定位方法檢測。
　　 6.血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離與培養(yǎng)：參考Jaffe等的方法(Jaffe et al.，1973)。
　　 7.細(xì)

12、胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平及分布檢測：免疫細(xì)胞化學(xué)染色法結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測粒鈣蛋白的分布。Western blot方法檢測粒鈣蛋白表達(dá)水平。
　　 8.利用RNA干擾技術(shù)降低HUVEC粒鈣蛋白表達(dá)水平：HUVEC細(xì)胞長至80-90％時(shí)，利用QIAGEN公司的轉(zhuǎn)染試劑將scramble RNA和靶向粒鈣蛋白的siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞，western blot方法檢測干擾效果。
　　 9.細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度檢測：利用高度特異性鈣

13、離子熒光探針Fluo-3 AM結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平變化。
　　 Ⅱ.肺腺癌細(xì)胞生長抑制、自噬和凋亡誘導(dǎo)劑的篩選及其作用機(jī)制研究
　　 1.倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)
　　 2.SRB方法檢測細(xì)胞存活率
　　 3.LDH(乳酸脫氫酶)法檢測細(xì)胞是否壞死
　　 4.吖啶橙(AO)染色以及Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和p62的蛋白水平檢測細(xì)胞是否發(fā)生自噬<

14、br>　　 5.Hoechst染色檢測細(xì)胞是否發(fā)生凋亡
　　 研究結(jié)果：
　　 Ⅰ.利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選和鑒定與ANXA7相互作用的蛋白并研究其在血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中的作用
　　 1.利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到四種與ANXA7相互作用的蛋白，分別為：粒鈣蛋白、T細(xì)胞抗原毒性顆粒相關(guān)RNA結(jié)合蛋白、補(bǔ)體因子H及纖維蛋白原β鏈相互作用。
　　 1.1誘餌表達(dá)載體構(gòu)建：ANXA7的開放閱讀框由1467個(gè)核苷酸序

15、列組成，重組載體NpGBKT7-ANXA7經(jīng)菌落PCR(圖Ⅰ-1-2)和限制性內(nèi)切酶SalⅠ和NotⅠ雙酶切(圖Ⅰ-1-3)均能在1500 bp處檢測到條帶，說明目的基因已連入載體中。測序結(jié)果沒有堿基突變，進(jìn)一步表明載體構(gòu)建正確。
　　 1.2誘餌蛋白毒性和自激活檢測：攜帶誘餌質(zhì)粒NpGBKT7-ANXA7和空載體NpGBKT7質(zhì)粒的AH109在固體SD/-Trp缺陷培養(yǎng)基的均生長良好，長出的單克隆克隆數(shù)目和大小大致相近(圖Ⅰ-

16、1-5)；在液體SD/-Trp缺陷培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，600nm的吸光度分別為1.51和1.54，表明誘餌蛋白對酵母細(xì)胞沒有毒性，不影響酵母的正常生長。自激活檢測確定了篩選文庫的最低3-AT濃度為2.5 mM(圖Ⅰ-1-6)。
　　 1.3 cDNA文庫篩選：將人肝臟cDNA文庫轉(zhuǎn)入攜帶誘餌質(zhì)粒NpGBKT7-ANXA7的酵母中共產(chǎn)生1.72×106個(gè)轉(zhuǎn)化子(圖Ⅰ-2-1)，經(jīng)第一輪篩選長出2000多個(gè)克隆(圖Ⅰ-2-2)。選取

17、直徑>2 mm得200個(gè)克隆分別利用HIS，ADE和LacZ三個(gè)報(bào)告基因進(jìn)行選擇(圖Ⅰ-2-3，Ⅰ-2-4，Ⅰ-2-5)。根據(jù)三輪篩選結(jié)果選取62個(gè)陽性克隆的文庫質(zhì)粒擴(kuò)增后進(jìn)行XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切驗(yàn)證，酶切片段長于500 bp的質(zhì)粒送交公司測序。
　　 1.4生物信息學(xué)分析：測序結(jié)果利用NCBI在線工具分析，去除公認(rèn)的假陽性克隆和重復(fù)克隆，共得到編碼四種蛋白的基因序列，分別是：粒鈣蛋白、T細(xì)胞抗原毒性顆粒相關(guān)RNA結(jié)合蛋白

18、、纖維蛋白原β鏈和補(bǔ)體因子H(表一)。
　　 2.ANXA7在細(xì)胞內(nèi)與粒鈣蛋白、T細(xì)胞抗原毒性顆粒相關(guān)RNA結(jié)合蛋白和纖維蛋白原β鏈發(fā)生相互作用
　　 2.1分別構(gòu)建攜帶GFP和Myc標(biāo)簽的pEGFP-ANAX7，pEGFP-GCA，pEGFP-TIA-1，pEGFP-FGB和pEGFP-CFH(圖Ⅰ-3-1)和pMyc-ANAX7，pMyc-GCA，pMyc-TIA-1，pMyc-FGB和pMyc-CFH(圖Ⅰ-3-2

19、)經(jīng)雙酶切驗(yàn)證及測序證實(shí)載體構(gòu)建成功。將10種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察(圖Ⅰ-3-3)和western blot檢測結(jié)果顯示融合蛋白的表達(dá)(圖Ⅰ-3-4，Ⅰ-3-5)。
　　 2.2將pEGFP-ANAX7與pMyc-GCA，pMyc-TIA-1，pMyc-CFH，pMyc-FGB共同轉(zhuǎn)染Cos7細(xì)胞，pMyc-C2作為空白對照。48h后裂解細(xì)胞，細(xì)胞裂解液以anti-Myc小鼠單克隆抗體進(jìn)行免疫沉

20、淀實(shí)驗(yàn)，western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶有Myc標(biāo)簽的四種文庫質(zhì)粒編碼蛋白均能將A7沉淀下來，而空白對照不能，說明四種蛋白和ANXA7存在相互作用(圖Ⅰ-3-6)。反向免疫共沉淀再次驗(yàn)證ANXA7和TIA-1與FGB具有相互作用(圖Ⅰ-3-7)。
　　 2.3利用GCA，TIA-1，CFH，F(xiàn)GB的抗體在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與GCA、TIA-1和FGB抗體孵育的細(xì)胞裂解液內(nèi)能檢測到ANXA7，而CFH抗體

21、則不能，說明在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ANXA7可以和GCA，TIA-1，F(xiàn)GB發(fā)生相互作用，不能和CFH發(fā)生相作用(圖Ⅰ-3-8)。
　　 3.GCA在ABO誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮自噬中發(fā)揮關(guān)鍵作用
　　 3.1 ABO增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞ANXA7和GCA的相互作用：分別用50μM R-ABO和S-ABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞6 h、12 h和24 h，取等蛋白量的細(xì)胞裂解液以GCA抗體進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)R-

22、ABO和S-ABO處理細(xì)胞12 h和24 h后，ANXA7的蛋白量顯著增多，說明ANXA7和GCA的相互作用均顯著增強(qiáng)(圖Ⅰ-4-2A，B)。同樣在未經(jīng)化合物處理的細(xì)胞提取液內(nèi)分別加入R-ABO，S-ABO和ABO(混合型)，隨后與GCA抗體4℃孵育過夜，western blot檢測ANXA7，結(jié)果再次表明R-ABO，S-ABO和ABO可以增強(qiáng)ANXA7和GCA的相互作用(圖Ⅰ-4-2C，D)。
　　 3.2 ABO調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮

23、細(xì)胞粒鈣蛋白的分布：以50μM ABO，R-ABO和S-ABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞24 h，免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法檢測粒鈣蛋白的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABO處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞中GCA的分布出現(xiàn)點(diǎn)狀簇集現(xiàn)象(圖Ⅰ-4-3)。
　　 3.3 RNA干擾下調(diào)粒鈣蛋白的表達(dá)水平：以20 nM和40 nM特異阻斷粒鈣蛋白表達(dá)的siRNA處理細(xì)胞24 h和48 h，利用western blot方法檢測干擾效果。結(jié)果表明20 nM和40 nM粒鈣蛋白的s

24、iRNA，24 h和48 h時(shí)均能有效抑制粒鈣蛋白的表達(dá)，其中40 nM效果較為顯著(圖Ⅰ-4-4)。
　　 3.4粒鈣蛋白參與ABO誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬：以40 nM粒鈣蛋白siRNA和scrambled RNA處理細(xì)胞24 h后，再利用ABO繼續(xù)處理24 h。免疫熒光染色結(jié)果顯示與對照組相比LC3-Ⅱ的點(diǎn)狀分布顯著減少(圖Ⅰ-4-5A，B)。Westernblot檢測結(jié)果顯示LC3-Ⅱ蛋白積累顯著減少(圖Ⅰ-4-5C，D)

25、。說明在ABO誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬中粒鈣蛋白發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　 3.5干擾GCA不影響ANXA7的蛋白表達(dá)：以40 nM粒鈣蛋白siRNA和scrambledRNA處理細(xì)胞24 h后，再利用ABO繼續(xù)處理24 h。Western blot檢測結(jié)果顯示未用ABO處理組ANXA7沒有顯著變化，而處理組ANXA7蛋白水平顯著上升(與前期已發(fā)表數(shù)據(jù)一致)，說明GCA不影響ANXA7的蛋白表達(dá)(圖Ⅰ-4-6)。
　　 3.6利

26、用RNA干擾技術(shù)抑制粒鈣蛋白表達(dá)引起細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度上升：利用siGCA下調(diào)粒鈣蛋白的表達(dá)，加入鈣離子熒光探針檢測，結(jié)果顯示游離Ca2+濃度顯著上升。說明粒鈣蛋白參與了對細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的調(diào)控(圖Ⅰ-4-7)。
　　 Ⅱ.肺腺癌細(xì)胞生長抑制、自噬和凋亡誘導(dǎo)劑的篩選及其作用機(jī)制研究
　　 1.12種吡唑酰胺衍生物(3a-31)對A549細(xì)胞生物活性的影響
　　 1.13a-31(結(jié)構(gòu)式圖Ⅱ-1)不影響A54

27、9細(xì)胞的形態(tài)：分別用8μM、16μM、32μM和64μM的處理A549細(xì)胞24h和48h，與對照組相比，化合處理組的細(xì)胞形態(tài)物無顯著變化，3e-3h在高濃度處理48h細(xì)胞數(shù)量有明顯減少，其它8種化合物無論細(xì)胞數(shù)量還是細(xì)胞形態(tài)都未發(fā)現(xiàn)明顯變化(圖Ⅱ-2A，Ⅱ-2B)。
　　 1.23e-3h抑制A549細(xì)胞增殖：SRB檢測結(jié)果表明3e-3h能不同程度的抑制A549細(xì)胞的生長，其中32μM和64μM有較好的抑制效果，抑制率在20％～

28、50％(圖Ⅱ-3)。
　　 1.33e-3h引起細(xì)胞中酸性膜泡增多：用32μM和64μM的3e-3h處理A549細(xì)胞24h和48h，吖啶橙染色結(jié)果顯示與對照組相比，32μM和64μM的3e-3h能夠使細(xì)胞內(nèi)的酸性膜泡明顯增多，其中64μM處理48h效果更顯著(圖Ⅱ-4)。說明上述化合物可能誘導(dǎo)了A549細(xì)胞自噬。為進(jìn)一步證實(shí)是否發(fā)生自噬，我們檢測了利用western blot方法檢測了自噬的標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ的積累和p62的降

29、解，結(jié)果顯示與對照組相比LC3-Ⅱ和p62蛋白水平并無顯著性變化，說明四種化合物不是通過誘導(dǎo)自噬抑制A549細(xì)胞增殖(圖Ⅱ-5)。
　　 1.43e-3h不引起細(xì)胞壞死：用64μM的3e-3h處理A549細(xì)胞48h，測定上清中乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)的活性，結(jié)果顯示與對照組相比，處理組LDH活性無顯著上升，表明3e-3h不引起A549細(xì)胞壞死(圖Ⅱ-6)。
　　 1.53e-3h不

30、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：Hoechst染色顯示化合物的處理細(xì)胞核均未出現(xiàn)凝集破碎或趨邊等凋亡特征，說明3e-3h不引起A549細(xì)胞凋亡(圖Ⅱ-7)。
　　 1.63e-3h阻滯細(xì)胞周期：流式細(xì)胞術(shù)檢測3e-3h對A549細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響，結(jié)果顯示四中化合物均能夠有效的將A549細(xì)胞周期阻滯在G1期(圖Ⅱ-8)。
　　 2.3e-3h對H322和H1299細(xì)胞生物活性的影響
　　 2.1利用16μM、32μM和64μM

31、的3e-3h處理H322細(xì)胞和H1299細(xì)胞24 h和48 h，形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞均表現(xiàn)出體積縮小，細(xì)胞膜邊緣凸起等凋亡特征(圖Ⅱ-9A，B；Ⅱ-10A，B)
　　 2.2 SRB檢測結(jié)果顯示32μM和64μM的3e-3h處理的細(xì)胞存活率明顯下降(圖Ⅰ-9C，Ⅰ-10C)
　　 2.3 Hoechst33258染色結(jié)果顯示，與對照組相比，化合物處理的細(xì)胞核明顯表現(xiàn)出收縮、凝集且被染為亮藍(lán)色等凋亡細(xì)胞的特征，說明細(xì)胞確

32、實(shí)發(fā)生了凋亡(圖Ⅰ-9 D，E；Ⅰ-10D，E)。
　　 3.3e-3h對正常胚肺細(xì)胞的影響
　　 我們進(jìn)一步研究了上述四種化合物對人正常胚肺細(xì)胞的影響，以32μM和64μM處理細(xì)胞48 h，SRB檢測結(jié)果表明細(xì)胞的生長基本不受影響，只有3e和3f在32μM有稍許促進(jìn)增殖的作用(圖Ⅱ-11)。
　　 結(jié)論：
　　 Ⅰ.本研究利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到四種和ANXA7相互作用的蛋白，這四種蛋白與ANXA7的關(guān)

33、系尚未有報(bào)道。
　　 1.成功構(gòu)建了酵母雙雜交誘餌載體NpGBKT7-ANXA7，并經(jīng)測序證實(shí)正確，為篩庫創(chuàng)造了條件。
　　 2.將重組誘餌質(zhì)粒NpGBKT7-ANXA7轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，檢測表達(dá)的融合蛋白對宿主菌無毒性和自激活作用，可進(jìn)一步用于篩選cDNA文庫。
　　 3.通過篩選成人肝臟cDNA文庫，經(jīng)四輪篩選逐步排除假陽性克隆，得到了62個(gè)陽性克隆，并經(jīng)測序及生物信息學(xué)分析后確定4個(gè)候選蛋白：粒鈣蛋白

34、，T細(xì)胞抗原毒性顆粒相關(guān)RNA結(jié)合蛋白，纖維蛋白原β鏈和補(bǔ)體因子H。
　　 4.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)粒鈣蛋白，T細(xì)胞抗原毒性顆粒相關(guān)RNA結(jié)合蛋白和纖維蛋白原β鏈與ANXA7在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用。
　　 5.粒鈣蛋白是EF手家族的鈣離子結(jié)合蛋白，其生物學(xué)功能尚不清楚。本研究首次發(fā)現(xiàn)粒鈣蛋白是ABO誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白。ABO能增強(qiáng)粒鈣蛋白和ANXA7的相互作用，抑制粒鈣蛋白的表達(dá)ABO不能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)