mtt分析法

1、懸浮細(xì)胞：MTT分析法是以活細(xì)胞代謝物還原劑3(45)dimethylthiahiazo(zy1)35diphenytetrazoliumroeMTT噻唑藍(lán)為基礎(chǔ)。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium環(huán)開裂，生成藍(lán)色的fmazan結(jié)晶，fmazan結(jié)晶的生成量僅與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的fma

2、zan結(jié)晶可在含50%的NN二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸鈉（pH4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶標(biāo)儀測定490nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。也可以用DMSO來溶解。MTT粉末和溶液保存時都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。實(shí)驗(yàn)的時候建議關(guān)閉超凈臺上的日光燈來避光。步驟如下：1:接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔1000－10000個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul。2:培養(yǎng)細(xì)胞：同一般

3、培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3－5天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時間）。3:呈色：培養(yǎng)35天后，每孔加MTT溶液（5mgml用PBS配）20ul.繼續(xù)孵育4小時，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。4：比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。注意事項(xiàng)：1、選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接

4、種濃度。2、避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。3、設(shè)空白對照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。MTT實(shí)驗(yàn)吸光度最后要在00.7之間，超出這個范圍就不是直線關(guān)系。例如：用96孔板培養(yǎng)SMMC7721肝癌做MTT測細(xì)胞活力應(yīng)該加200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO。加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO溶解甲臜顆

5、粒進(jìn)行比色測定。一般每孔4000個細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在20000個ml，MTT加20ul，作用四小時后洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然后每孔加150ulDMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。貼壁細(xì)胞：MTT黃色的噻唑蘭，簡稱MTT，可透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性MTT還原為難溶于水的藍(lán)紫色的針狀Fmazan結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，結(jié)晶物能被二甲基亞砜（DMSO）溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm

6、波長處測定其光吸收值，可間接反映細(xì)胞數(shù)量。二、實(shí)驗(yàn)步驟（實(shí)用于貼壁細(xì)胞）1）收集對數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于96孔板，每孔180μl，300010000個孔。2）置37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)624小時。3）加入待篩樣品20μl，繼續(xù)培養(yǎng)44小時。MTTMTT原理原理MTT全稱為3(45)dimethylthiahiazo(zy1)35diphenytetrazoliumroe，漢語化學(xué)名為3(4，5二甲基噻唑2)2

7、，5二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Fmazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子

8、的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機(jī)溶劑對實(shí)驗(yàn)者也有損害。MTTMTT溶液的配制方法溶液的配制方法通常，此法中的MTT濃度為5mgml。因此，可以稱取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜

9、過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。實(shí)驗(yàn)的時候我一般關(guān)閉超凈臺上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。需要注意的是，MTT法只能用來檢測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，但不能測定細(xì)胞絕對數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果的時候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT吸光度最好在00.7范圍內(nèi)。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4C避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mgml保存在20度長期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光

10、袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了。MTT有致癌性，用的時候小心有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關(guān)掉.配制MTT時用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl8g＋Kcl0.2g＋