mtt實(shí)驗(yàn)原理、步驟、注意事項(xiàng)

1、MTT實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)原理；原理；步驟；步驟；注意事項(xiàng)；注意事項(xiàng)；一、原理一、原理MTT全稱為3(45)dimethylthiahiazo(zy1)35diphenytetrazoliumroe，漢語化學(xué)名為3(4，5二甲基噻唑2)2，5二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。MTT比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Fmazan）并沉積在

2、細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測(cè)定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。缺點(diǎn)缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測(cè)。這不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性

3、產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害。MTT溶液的配制方法：通常，此法中的MTT濃度為5mgml。因此，可以稱取MTT0.5克，溶于100ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。實(shí)驗(yàn)的時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺(tái)上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。需要注意的是，MTT法只能用來檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。在

4、用酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT吸光度最好在00.7范圍內(nèi)。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4C避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mgml保存在20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就絕對(duì)不能再用了。MTT有致癌性，用的時(shí)候小心有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成

5、的MTT需要無菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉.配制MTT時(shí)用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：Nacl8g＋Kcl0.2g＋Na2HPO41.44g＋KH2PO40.24g調(diào)pH7.4定容1L。二、幾種二、幾種MTT法實(shí)驗(yàn)步驟法實(shí)驗(yàn)步驟普通普通MTT法實(shí)驗(yàn)步驟法實(shí)驗(yàn)步驟：1：接種細(xì)胞接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔100

6、010000個(gè)細(xì)胞（細(xì)胞濃度的問題見后面的注意事項(xiàng)）接種到96孔板，每孔體積200ul.2:培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)35天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。3：呈色呈色：培養(yǎng)35天后，每孔加MTT溶液（5mgml用PBS配制，pH=7.4)10ul.繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清多敏感性降低，太少觀察不到差異。因此，很多高手總結(jié)出“寧少勿多寧少勿多”的原則，這一

7、原則在大多數(shù)情況下是適用的。對(duì)于體積大，增殖快的細(xì)胞，比如腫瘤細(xì)胞，在96孔板中不能接種太多數(shù)目的細(xì)胞。一般應(yīng)該少于104個(gè)孔。同時(shí)，細(xì)胞貼壁后不可培養(yǎng)過久，以防過于密集。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞最佳點(diǎn)板濃度在40005000孔，太少的話SD值會(huì)很大。對(duì)于體積小，增殖慢、懸浮的細(xì)胞，在96孔板中可以接種更多數(shù)目的細(xì)胞。甚至可以超過105個(gè)孔。同時(shí)，為了觀察藥物對(duì)這類細(xì)胞的效果，可以較上一種細(xì)胞培養(yǎng)更長(zhǎng)時(shí)間。在做腫瘤細(xì)胞的時(shí)候，往往要根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速

8、度以及藥物的特性(有時(shí)間依賴性和濃度依賴性的藥物)來確定培養(yǎng)時(shí)間是48小時(shí)還是72小時(shí).(2)設(shè)置調(diào)零孔設(shè)置調(diào)零孔（只加培養(yǎng)基100ul、MTT10ul、二甲基亞砜100ul）。(3)設(shè)置空白孔設(shè)置空白孔（細(xì)胞、藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液共100ul、10ulMTT、100ul二甲基亞砜）。(4)MTT實(shí)驗(yàn)吸光度吸光度最后要在00.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系。(5)96孔板邊緣邊緣32孔用無菌孔用無菌PBS填充填充因?yàn)檫吘壍?2孔中水

9、分蒸發(fā)很快，藥物易被濃縮，對(duì)實(shí)驗(yàn)影響大。同時(shí)加入pbs液填充后，可以一定程度上保持中間孔的水分。(6)防止藥物與防止藥物與MTT反應(yīng)。反應(yīng)。如果96孔板中加入了具有氧化還原性的藥物，比如谷胱甘肽、VitE、VitC，那建議你用PBS將細(xì)胞洗洗，否則這些藥物會(huì)將MTT還原成棕褐色沉淀，這種效果可能是你不需要的。(7)吸收值分析吸收值分析在理想的MTT實(shí)驗(yàn)中，如果是細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)，不加藥物處理的空白組空白組的吸收值應(yīng)該在吸收值應(yīng)該在0.81.