膠體金免疫層析法檢測鼠疫IgM抗體的實驗研究.pdf

1、目的：（1）建立鼠疫動物模型，并觀察鼠疫F1IgM抗體的動態(tài)變化規(guī)律。（2）建立檢測F1—IgM抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗（FI—IgM—ELISA）。（3）建立免疫膠體金標法檢測人的F1—IgM抗體（FI—IgM—GICA）的方法。（4）對上述技術方法作出評價。 方法：（1）純化鼠疫F1抗原，利用F1抗原、抗μ鏈抗體作為檢測手段構(gòu)成ELISA間接法。（2）用鼠疫F1單克隆IgM抗體為標準物，建立檢測鼠F1 IgM抗體的酶聯(lián)免疫吸附

2、實驗（ELISA）。（3）采用不同的兩種免疫方式和三種的菌濃度免疫小鼠，用上述已建立的ELISA法檢測免疫后的小鼠血清，篩選出免疫效果最佳的菌濃度。（4）再利用所篩選出的最佳菌濃度再次免疫小鼠，追蹤觀察每天鼠的特異性IgM抗體和IgG抗體出現(xiàn)的滴度和持續(xù)時間。（5）對ELISA的特異性的評價，選擇鼠疫菌的近緣菌和與鼠疫產(chǎn)生相似的臨床癥狀的致病菌與鼠疫菌同時平行免疫小鼠后進行檢測，觀察是否有交叉反應。（6）對ELISA敏感性的評價，采用統(tǒng)

3、計學的分析方法計算敏感性。（7）對ELISA重復性和穩(wěn)定性的評價，將鼠疫菌免疫小鼠后的鼠疫IgM陽性血清及鼠疫IgM抗體陰性的鼠血清各5份，在同一塊板上重復加樣5次（孔），測定其重復性。（8）選擇陽性血清和陰性血清各1份在不同時間和不同板進行5次測定，觀察其穩(wěn)定性。（9）利用純化的F1抗原、羊抗鼠抗μ鏈抗體（或羊抗人抗μ鏈抗體）構(gòu)建膠體金免疫層析法檢測鼠F1IgM早期抗體，并對GICA進行敏感性、特異性的實驗室評價。（10）采集鼠疫頻發(fā)

4、地區(qū)（梁河）人血清標本，進行篩檢，對免疫膠體金標層析法進行現(xiàn)場評價。 結(jié)果：（1）成功地純化了鼠疫F1抗原。（2）用棋盤滴定法，選擇出10μg/ml抗原包被濃度和1：15000酶標記二抗?jié)舛?，建立了間接ELISA法檢測鼠源F1IgM抗體的方法。（3）鼠疫菌與近緣菌同時平行免疫小鼠后，用間接ELISA法檢測，近緣菌結(jié)果為陰性，未見交叉反應。動物免疫后，獲得70份小鼠血清進行檢測，其敏感性是75%。重復性實驗中，間接ELISA法的批