絕經(jīng)后壓力性尿失禁婦女尿道旁陰道前壁組織microRNA表達譜及其靶標分析.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類約22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA,廣泛存在于動植物細胞中,是一種新型的基因表達調(diào)控因子,負向調(diào)控靶基因(mRNA)表達,是近幾年生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。miRNA通過調(diào)節(jié)目的靶基因的表達,在生物體發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖、凋亡等生理和病理過程中均發(fā)揮重要作用。應(yīng)用芯片技術(shù)篩查miRNA表達譜、驗證及鑒定其靶基因以及進一步研究其生物學(xué)功能的實驗方法得到廣泛應(yīng)用。探索miRNA在基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的

2、功能,揭示其在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的重要角色,為miRNA在疾病基因診斷、治療的臨床應(yīng)用提供實驗室依據(jù)。
　　 壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)屬于盆底功能障礙性疾患(pelvic floor dysfunction,PFD),是困擾中老年女性健康的普遍問題,是涉及社會學(xué)和衛(wèi)生經(jīng)濟學(xué)的健康問題。大量流行病學(xué)研究顯示絕經(jīng)是SUI發(fā)病的重要高危因素。目前SUI在流行病學(xué)調(diào)查、解剖改變、臨床

3、特性以及組織化學(xué)方面的研究取得了一定進展,然而這些多為疾病表觀、形態(tài)學(xué)上的研究,尚無哪種分子機制得到深入探索并被廣泛接受。多項設(shè)計嚴謹?shù)碾p胞胎問卷調(diào)查研究強調(diào)了“內(nèi)在的、遺傳性”因素在SUI發(fā)生發(fā)展中的作用。我們課題組前期研究運用人類全基因組表達譜芯片篩選出75個在絕經(jīng)后SUI組與正常對照組之間差異表達的基因,其中31個基因表達上調(diào),44個基因表達下調(diào)。實時熒光定量PCR、Western Blot驗證了目標差異基因在SUI組的表達變化趨

4、勢與芯片一致,佐證了芯片結(jié)果的可信性,同時分析了其功能蛋白的作用,認為神經(jīng)損傷變性通路的基因表達產(chǎn)物參與了SUI的發(fā)生發(fā)展。
　　 迄今為止,國內(nèi)外尚無microRNA在女性盆底功能障礙性疾病中的研究報道。本研究即從microRNA的角度,進一步探討絕經(jīng)后SUI發(fā)生發(fā)展的分子機制。
　　 陰道前壁提供尿道與膀胱頸部以穩(wěn)定的基石作用,阻止腹壓增加時尿道及膀胱頸部的下移,其組織成分的改變導(dǎo)致機械穩(wěn)定性的減弱,對于SUI病理生

5、理學(xué)發(fā)生發(fā)展機制至關(guān)重要。所以本研究選擇尿道與膀胱連接處相當于膀胱頸部的陰道前壁組織作為實驗標本。
　　 ●研究目的
　　 通過芯片技術(shù)檢測microRNA在絕經(jīng)后SUI組與正常對照組尿道旁陰道前壁組織的差異表達,結(jié)合本課題組前期基因芯片研究結(jié)果以及microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫進行交叉比對、雙向預(yù)測篩選,并行進一步的驗證,從而初步構(gòu)建絕經(jīng)后SUI“microRNA-靶基因-蛋白質(zhì)”相互調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)。從microRNA的

6、角度,進一步探討絕經(jīng)后SUI發(fā)生發(fā)展的分子機制。
　　 ●研究方法
　　 1.在年齡、產(chǎn)次、分娩方式、體重指數(shù)、絕經(jīng)狀態(tài)、相關(guān)病史等可能影響SUI發(fā)生發(fā)展的重要混雜因素匹配的前提下,選取3例絕經(jīng)后SUI與3例絕經(jīng)后無SUI對照病例的尿道旁陰道前壁組織標本。提取總RNA,并行定量、質(zhì)檢。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后進行TaqMan(R) Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0表達譜芯片研

7、究。
　　 2.結(jié)合本課題組前期.Affymetrix GeneChip(R)Human Genome U133 Plus2.0基因芯片結(jié)果(一種全新的“基因芯片～microRNA芯片”相結(jié)合的方法)以及microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫進行交叉比對篩選,獲得調(diào)控的靶基因,用MAS4.0軟件對差異表達基因進行基因功能分類注釋(GO)和代謝通路分析(Pathway)。
　　 3.進一步擴大樣本量至各組10例,采用實時熒光定量PC

8、R、免疫組化技術(shù)、WesternBlot技術(shù)檢測絕經(jīng)后SUI組和對照組差異microRNA、靶基因mRNA和蛋白水平的表達,驗證芯片的準確性,以進一步分析差異表達的microRNA及靶基因在SUI發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 ●研究結(jié)果
　　 1.提取總RNA經(jīng)定量和電泳檢測,質(zhì)量滿足芯片分析要求。芯片各項檢測參數(shù)均達到質(zhì)控要求,成功建立尿道旁陰道壁組織與microRNA表達譜芯片的研究模型。
　　 2.microR

9、NA表達譜芯片篩選出12個在SUI組和對照組間差異表達的microRNA,其中5個表達上調(diào),7個表達下調(diào)。
　　 3.通過結(jié)合本課題組前期基因芯片結(jié)果以及microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫,交叉比對、雙向預(yù)測篩選出4個靶基因GRB2、BICD2、STAT3、RAPTOR(其中GRB2、BICD2和STAT3表達上調(diào),RAPTOR表達下調(diào)),其功能基本與神經(jīng)變性相關(guān)。負向調(diào)控其功能的4個相對應(yīng)的差異microRNA分別為hsa—miR-

10、124,hsa—miR-330—3p,hsa-miR-93＃,hsa-let-7a(其中hsa—miR-124、hsa—mir-330—3p、hsa—miR-93＃表達下調(diào),hsa—let-7a表達上調(diào))。
　　 4.經(jīng)基因功能分類注釋(GO)和代謝通路分析(Pathway),這四個靶基因分別代表3個不同通路,GRB2為神經(jīng)變性相關(guān)基因；RAPTOR為signaling pathway通路的代表基因；BICD2、STAT3為物質(zhì)

11、代謝通路的功能基因,其蛋白功能也與神經(jīng)變性相關(guān),亦可歸類于神經(jīng)變性相關(guān)基因。
　　 5.進一步驗證表明microRNA、靶基因及蛋白水平的差異表達趨勢與芯片結(jié)果一致。
　　 ●結(jié)論
　　 1.microRNA表達譜芯片篩選出12個在SUI組和對照組間差異表達的microRNA,其中5個表達上調(diào),7個表達下調(diào)。
　　 2.基因表達譜芯片與microRNA表達譜芯片的結(jié)合可以大幅度縮小microRNA與靶基因