成骨分化的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性研究.pdf

1、目的:(1)通過(guò)觀察體外培養(yǎng)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical cordblood-mesenchymal stem cells，UCB-MSCs)并作誘導(dǎo)成骨分化，探討其作為組織工程的骨種子細(xì)胞的可行性。(2)通過(guò)建立混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系模擬成骨分化的UCB-MSCs移植入體內(nèi)的免疫微環(huán)境條件，并觀察在不同免疫微環(huán)境條件下成骨分化的UCB-MSCs免疫相關(guān)膜蛋白的表達(dá)與可溶性細(xì)胞因子的分泌水平，研究成骨分化UCB-MSCs產(chǎn)生免疫

2、原性的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:體外分離培養(yǎng)UCB-MSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原的表達(dá)及其變化規(guī)律;體外成骨誘導(dǎo)人UCB-MSCs2周，采用Alizarin Red染色和鈣離子半定量測(cè)定的方法評(píng)價(jià)細(xì)胞成骨活性。取P2代UCB-MSCs細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)加入IFN-γ前后的HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ、CD40、CD80等分子的表達(dá)情況;流式細(xì)胞儀檢測(cè)UCB-MSCs在成骨誘導(dǎo)分化前后HLA-Ⅰ類分子、HLA-Ⅱ類分子的表達(dá)情況以觀

3、察成骨誘導(dǎo)分化的MSCs免疫抗原性的變化。體外分離外周血T淋巴細(xì)胞，成骨分化與未分化的UCB-MSCs分別與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，模擬移植入宿主體內(nèi)的未激活狀態(tài)的免疫微環(huán)境，3H-TdR摻入法檢測(cè)IFN-γ刺激前后的異體淋巴細(xì)胞增殖情況，以評(píng)測(cè)成骨分化前后的UCB-MSCs對(duì)異體淋巴細(xì)胞增殖的影響。建立隔離腔(Transwell)非接觸共培養(yǎng)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系，評(píng)價(jià)成骨誘導(dǎo)分化前后的UCB-MSCs對(duì)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響。ELISA定量檢

4、測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4的含量，觀察成骨誘導(dǎo)分化的UCB-MSCs對(duì)IFN-γ、IL-4分泌水平的影響。
　　結(jié)果:第1、3、5代細(xì)胞的CD29、CD105和CD166均呈陽(yáng)性表達(dá)，而造血細(xì)胞系的表面標(biāo)記CD31、CD34和CD45則呈低表達(dá)，且隨傳代次數(shù)增加含量逐漸下降。UCB-MSCs成骨誘導(dǎo)2周后，Alizarin Red染色為陽(yáng)性。對(duì)照組則無(wú)明顯鈣鹽沉積。鈣離子半定量的檢測(cè)結(jié)果則表明，UCB-MSCs成骨誘導(dǎo)2周后

5、的鈣離子含量遠(yuǎn)高于未誘導(dǎo)組。
　　流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，人UCB-MSCs高表達(dá)HLA-Ⅰ類分子，不表達(dá)HLA-Ⅱ類分子和CD40，CD80等共刺激分子;經(jīng)IFN-γ刺激誘導(dǎo)后，HLA-Ⅰ類分子的表達(dá)未發(fā)生改變，HLA-Ⅱ類分子呈陽(yáng)性表達(dá)，而CD40和CD80的表達(dá)仍為陰性。人UCB-MSCs在成骨誘導(dǎo)分化前后HLA-Ⅰ類分子均為陽(yáng)性表達(dá);而HLA-Ⅱ類分子在成骨分化前為陰性，誘導(dǎo)后陽(yáng)性表達(dá)率增高。
　　UCB-MSCs單向

6、刺激淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的結(jié)果顯示，無(wú)論是否有HLA-Ⅱ類分子的表達(dá)（IFN-γ的刺激），UCB-MSCs對(duì)異體淋巴細(xì)胞增殖均有明顯的抑制效果，并且淋巴細(xì)胞的增殖在不同比例的共培養(yǎng)組之間也有顯著性差異。而成骨誘導(dǎo)分化的UCB-MSCs對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制作用明顯減弱（不隨細(xì)胞數(shù)量的改變而改變），并且在IFN-γ作用后，反而有刺激淋巴細(xì)胞增殖的效果。1×104及以上數(shù)量級(jí)的未誘導(dǎo)UCB-MSCs可以抑制PHA刺激的淋巴細(xì)胞增殖，但加入IL-2

7、后，這種抑制作用被逆轉(zhuǎn)。而成骨誘導(dǎo)分化的UCB-MSCs則不具有抑制淋巴細(xì)胞增殖的作用。
　　Transwell共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與直接接觸培養(yǎng)相似，UCB-MSCs能夠顯著抑制淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，而成骨誘導(dǎo)分化的UCB-MSCs的免疫抑制能力明顯減弱。未誘導(dǎo)UCB-MSCs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)7天，培養(yǎng)液上清中IFN-γ分泌水平下降，IL-4含量則顯著上調(diào)。而成骨分化的UCB-MSCs與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)7天后，IFN-γ分泌水平較對(duì)照