復(fù)合PRP聯(lián)合bBMP組織工程骨修復(fù)兔橈骨缺損的實驗研究.pdf

1、背景及目的：
　　 骨缺損的修復(fù)和再生一直是骨科學(xué)研究領(lǐng)域中的重要課題，目前研究熱點(diǎn)是利用生長因子來促進(jìn)、增強(qiáng)骨的爬行替代和新骨形成的能力，對骨缺損的修復(fù)及愈合起重要作用。富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)是自體全血經(jīng)過離心得到的血小板濃縮物，其血小板濃度至少為全血中血小板濃度的4倍以上。血小板釋放的生物活性物質(zhì)包括ADP、ATP、血管生成素-2(Angiopoietin-2，Ang-2)、結(jié)締組織

2、激活肽-3(Connective Tissue-Activating PeptideⅢ，CATPⅢ)、表皮生長因子( Epidermal Growth Factor, EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basicFibroblast Growth Factor, bFGF)、胰島素樣生長因子(Insulin-like Growth Factor-I，IGF-I)、骨鈣素(Osteocalcin P-Selectin，GMP-140)、血

3、小板源性內(nèi)皮細(xì)胞生長因子( Platelet-derived endothelial cell growth factor, PDECGF)、血小板衍生生長因子( Platelet-derived Growth Factor, PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming GrowthFactor-b1，TGF-b1)、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)，以上成分均具

4、有促進(jìn)組織愈合和組織再生的功能。富血小板血漿因其制備簡單，價格低廉，自體取血既無毒性又無免疫原性，其釋放的多種生長因子非常的符合人體生長因子的配比，因此被視為較為理想的符合臨床治療骨缺損需要的生長因子來源。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）能誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞向骨系細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)骨細(xì)胞的生長增殖。并進(jìn)而合成膠原，形成鈣化的骨組織能力，它可以促進(jìn)原位或異位骨的形成。骨形態(tài)發(fā)生蛋白和PRP激活

5、后所釋放的多種生長因子聯(lián)合作用具有明顯的促進(jìn)骨組織缺損的愈合和重塑。
　　 本實驗通過組織學(xué)觀察及計算機(jī)圖像分析等方法，觀察自體富含血小板血漿及牛骨形態(tài)發(fā)生蛋白對兔橈骨缺損區(qū)骨組織再生與修復(fù)能力的影響，為臨床骨缺損修復(fù)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 材料及方法
　　 1動物分組及模型制備
　　 選擇健康新西蘭大白兔48只隨機(jī)分為A、B、C、D三組，每組12只。A組橈骨缺損處植入復(fù)合型組織工程骨(PRP+FG+

6、bBMP);B、C兩組分別植入復(fù)合材料(PRP+FG)和(bBMP+FG);D組為空白組，只植入FG。根據(jù)骨缺損大小植入材料體積約2.0ml，上述材料均為膠狀。逐層縫合切口，術(shù)后3d肌注青霉素40萬u/d。
　　 2PRP的制作
　　 整個制作過程嚴(yán)格無菌，0.03g/L戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉，從兔耳中央動脈抽取5ml自體血，裝在預(yù)先放有0.5ml復(fù)方枸櫞酸鈉抗凝劑的10ml離心管中，參照Landeaserg法進(jìn)行P

7、RP提取。
　　 3組織工程骨的構(gòu)建
　　 取48mg bBMP放入蒸餾水中浸泡，4℃冰箱過夜。取出bBMP，研磨成碎末狀后與PRP和FG根據(jù)骨缺損創(chuàng)面大小注入容器中，然后取凝血劑（由1ml:10％的氯化鈣與1000u凝血酶混合而成）按照1ml:200mg將PRP/bBMP混合物制成凝膠，然后將PRP/bBMP混合物凝膠貼于橈骨骨缺損處。凝膠制作及應(yīng)用應(yīng)在40分鐘內(nèi)完成。
　　 4大體觀察
　　 動物飲食

8、、精神狀態(tài)，切口愈合情況，觀察植入物的體積變化，與周圍組織結(jié)合的緊密程度，植入物表面的變化，有無炎癥反應(yīng)。
　　 5組織學(xué)觀察
　　 6X線片檢查
　　 術(shù)后4、8和12周拍攝雙前肢正側(cè)位X線片，觀察骨缺損修復(fù)情況。
　　 每個標(biāo)本選取2張HE切片，每個切片取4個視野，應(yīng)用QwIN圖像分析系統(tǒng)采集圖像并分析，統(tǒng)計四組新生骨在骨缺損區(qū)所占的面積百分比，并進(jìn)行比較。
　　 8統(tǒng)計學(xué)方法
　　

9、數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，同一時間點(diǎn)各組間的差異LSD法比較。檢驗水準(zhǔn)取α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 1一般情況術(shù)后所有動物飲食、行動、精神、毛發(fā)色澤、大小便正常。手術(shù)切口無紅腫、滲血及膿性分泌物，切口均一期愈合。
　　 2組織學(xué)觀察術(shù)后4周，A組骨缺損處見新生血管豐富，可見較多的纖維性骨痂形成。局部見較多成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞增生活躍，可見與骨干平行

10、的骨樣組織。B、C組可見纖維組織結(jié)構(gòu)，其間散在數(shù)量不等的成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，成骨作用較A組差。D組見纖維組織生長，材料降解為網(wǎng)狀，周圍有炎性細(xì)胞和少量骨母細(xì)胞。術(shù)后8周，A組骨缺損區(qū)可見大量的新生骨樣組織，骨基質(zhì)豐富，可見鈣鹽沉積，軟骨組織數(shù)量減少。B、C組新生骨組織呈交織狀，可見骨基質(zhì)和少量鈣鹽沉積，數(shù)量小于A組。D組可見未被完全機(jī)化的纖維組織和少量炎性細(xì)胞。12周，A組為成熟骨組織結(jié)構(gòu)，主要為板層骨，散在少量的編織骨，可見少量破骨細(xì)

11、胞，骨髓腔完全再通。B組編織骨較多，可見成骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞及少量骨髓組織。C組骨組織成熟度稍差，亦可見髓腔內(nèi)有血細(xì)胞。D組仍為纖維組織填充，較少的骨基質(zhì)和新生骨組織。
　　 3X線片觀察A組術(shù)后4周骨缺損處呈斑片狀模糊陰影，斷端較清晰，兩斷端部密度稍高。術(shù)后8周時兩斷端模糊，骨缺損處為連續(xù)性高密度陰影，橈骨缺損處可見連續(xù)性骨痂形成，兩斷端間形成橋接。12周時骨缺損處呈均勻一致高密度影，骨皮質(zhì)連續(xù)，髓腔貫通。B組術(shù)后4周，骨缺損處

12、為連續(xù)性絮狀模糊陰影，斷端清晰。術(shù)后8周骨缺損區(qū)模糊，為連續(xù)性高密度陰影，骨痂量較A組為少。12周時骨缺損基本修復(fù)，髓腔大部分再通。C組術(shù)后4周時，截骨端及缺損區(qū)有密度較低的骨痂形成，缺損區(qū)部分為骨痂填充。術(shù)后8和12周時，骨缺損處部分由新生骨所填充，可見髓腔部分再通。D組術(shù)后4周時，骨缺損區(qū)未見明顯成骨，斷端清晰，缺損區(qū)域未見修復(fù)。術(shù)后8和12周時，髓腔部分閉合，骨缺損區(qū)未見明顯修復(fù)，斷端髓腔閉合。
　　 4.計算機(jī)圖像分析隨

13、著時間的推移，新骨形成逐漸增多，材料逐漸被降解。術(shù)后4、8、12周，A組橈骨缺損處修復(fù)性新骨形成均多于B、C和D組(P＜0.01)；術(shù)后4周，B組新骨形成略多于C組，但兩組間無明顯差異（P＞0.05）：術(shù)后8周、12周，B組新骨形成多于C組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1在兔橈骨缺損的修復(fù)和愈合方面單獨(dú)應(yīng)用PRP和單獨(dú)應(yīng)用BMP均可促進(jìn)骨缺損的修復(fù)，但前者較后者更有利于促進(jìn)骨愈合；
　　 2PRP聯(lián)合B