Hedgehog信號(hào)通路在人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨過(guò)程中調(diào)控作用的探索性研究.pdf

1、正畸臨床中對(duì)牙齒施加合適的正畸力后，圍繞牙根的牙槽骨和牙周膜將發(fā)生適應(yīng)性改變，進(jìn)而牙齒將發(fā)生位置的移動(dòng)。牙齒移動(dòng)過(guò)程中張力側(cè)主要是成骨過(guò)程而壓力側(cè)主要是骨吸收過(guò)程，兩側(cè)平衡協(xié)調(diào)共同作用而使牙齒發(fā)生預(yù)期的移動(dòng)。在張力側(cè)以成骨活動(dòng)為主的骨改建過(guò)程中，牙周膜組織發(fā)揮了重要的介導(dǎo)作用。通過(guò)體內(nèi)外研究，現(xiàn)在已經(jīng)證實(shí)正畸力的刺激通過(guò)胞外基質(zhì)傳導(dǎo)至胞漿內(nèi)，引起一系列細(xì)胞因子的合成，包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、酶類(lèi)以及結(jié)構(gòu)分子類(lèi)的表達(dá)和合成，并參與了細(xì)胞的

2、分化、增殖以及功能的變化，如前列腺素類(lèi)(PGs)、環(huán)單磷酸腺苷(cAMP)、肌醇磷酸類(lèi)、鈣離子通道、分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路等信號(hào)參與了人牙周膜細(xì)胞的成骨分化過(guò)程。而細(xì)胞在機(jī)械應(yīng)力作用下成骨過(guò)程并非只是啟動(dòng)某一個(gè)的信號(hào)通路，而是多種通路在時(shí)空順序上的協(xié)同作用。但這個(gè)成骨過(guò)程的具體機(jī)制目前并不明了。
　　 早期研究表明：Hedgehog(Hh)信號(hào)通路對(duì)多種動(dòng)物以及人體組織和器官的形態(tài)發(fā)生有著至關(guān)重要的調(diào)控作用，對(duì)成體組

3、織的功能穩(wěn)定和干細(xì)胞的增生分化也有促進(jìn)作用。但在脊椎動(dòng)物和果蠅間，Hh信號(hào)通路總體的作用機(jī)制和大多數(shù)的關(guān)鍵信號(hào)通路因子是保守的。近期研究表明：在脊椎動(dòng)物中，Hh蛋白有三種同源體，Sonichedgehog(Shh)，Indian hedgehog(Ihh)，Desert hedgehog(Dhh)，而其中的Shh和Ihh與成骨分化關(guān)系密切。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Hh信號(hào)通路在間充質(zhì)細(xì)胞的成骨化過(guò)程中發(fā)揮了積極的調(diào)控作用。
　　 本課題組在前

4、期工作中，不僅成功分離獲取了人牙周膜干細(xì)胞(human periodontalligament stem cells，PDLSC)，還經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，PDLSC在動(dòng)態(tài)張應(yīng)力作用下向成骨細(xì)胞分化，但調(diào)控機(jī)制不明。鑒于Shh和Ihh與多樣細(xì)胞的成骨作用有著密切關(guān)系，我們推測(cè)Hh信號(hào)通路可能在PDLSC應(yīng)力成骨細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮了作用，并據(jù)此設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，首先初步探明PDLSC在應(yīng)力成骨的同時(shí)，Hh信號(hào)通路被激活；再通過(guò)激動(dòng)劑purmorpham

5、ine和抑制劑cyclopamine調(diào)控Hh信號(hào)通路的活性，借以佐證Hh信號(hào)通路對(duì)PDLSC應(yīng)力成骨的調(diào)控作用，以期從分子水平探討矯治性牙位移動(dòng)的發(fā)生機(jī)制，為深入研究矯治性牙位移動(dòng)機(jī)理建立一個(gè)全新的實(shí)驗(yàn)研究模型。
　　 目的：利用體外分離培養(yǎng)的PDLSC，并經(jīng)細(xì)胞應(yīng)力實(shí)驗(yàn)證實(shí)Hh信號(hào)通路對(duì)PDLSC應(yīng)力成骨的調(diào)控作用，探索PDLSC的應(yīng)力成骨調(diào)控機(jī)制。
　　 方法
　　 1人牙周膜干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

6、　　 在西南醫(yī)院口腔科取12～24歲間因正畸需要而拔除的健康前磨牙或阻生的第三磨牙，牙周牙體及全身狀況均健康，并經(jīng)知情同意。刮取牙根中三分之一的牙周膜組織，經(jīng)Ⅰ型膠原酶消化40分鐘，離心收集后種于6孔板原代培養(yǎng)。獲得牙周膜細(xì)胞后，通過(guò)改良法克隆化培養(yǎng)得到PDLSC，經(jīng)測(cè)定細(xì)胞克隆形成率、免疫熒光檢測(cè)角蛋白及波形蛋白、流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO-1和CD146以及成骨、成脂誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行干細(xì)胞特性的鑒定，為PDLSC應(yīng)力成骨

7、實(shí)驗(yàn)和Hh信號(hào)通路效應(yīng)蛋白的檢測(cè)作準(zhǔn)備。
　　 2動(dòng)態(tài)張應(yīng)力下人牙周膜干細(xì)胞成骨過(guò)程中Hh通路的檢測(cè)
　　 為了解PDLSC應(yīng)力成骨過(guò)程中，Hh信號(hào)通路的活性狀況。本研究取第4～6代PDLSC種于BioFlex專(zhuān)用加載六孔培養(yǎng)板(孔底為硅膠膜)內(nèi)，在礦化誘導(dǎo)環(huán)境下運(yùn)用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化水準(zhǔn)的FX-4000T加載系統(tǒng)進(jìn)行動(dòng)態(tài)張應(yīng)力加載，方式為最大形變12%、最小形變?yōu)?的正弦波，頻率為0.1 Hz(5 s拉抻5s放松)張應(yīng)力，作用

8、時(shí)間24 h，對(duì)照組的BioFlex板靜置培養(yǎng)不加力；以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)張應(yīng)力作用下，PDLSC成骨標(biāo)志物Runx2、ALP的mRNA的合成與表達(dá)的改變；以及Hh信號(hào)通路關(guān)鍵效應(yīng)蛋白GLI1、PTCH1、SMO的mRNA的合成與表達(dá)的改變。
　　 3 purmorphamine對(duì)人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨的影響
　　 為證實(shí)Hh信號(hào)通路對(duì)PDLSC應(yīng)力成骨的正向調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)取

9、第4～6代PDLSC種于BioFlex專(zhuān)用加載六孔培養(yǎng)板，在礦化誘導(dǎo)環(huán)境下加入不同濃度的purmorphamine(1μM，2μM，4μM)，加載最大形變?yōu)?2％、最小形變?yōu)?的正弦波，頻率為0.1 Hz(5 s拉抻5s放松)張應(yīng)力，對(duì)照組在BioFlex板孔內(nèi)只加入purmorphamine溶劑DMSO(10-2M)，作用24 h，以real-time PCR檢測(cè)張應(yīng)力作用前后，PDLSC成骨相關(guān)標(biāo)志物Runx2、ALP合成與表達(dá)的變

10、化；Hh信號(hào)通路的相關(guān)標(biāo)志物GLI1、PTCH1、SMO在mRNA水平表達(dá)的變化情況。
　　 4 cyclopamine對(duì)人牙周膜干細(xì)胞應(yīng)力成骨的影響
　　 為證實(shí)Hh信號(hào)通路對(duì)PDLSC應(yīng)力成骨的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)取第4～6代PDLSC種于BioFlex專(zhuān)用加載六孔培養(yǎng)板內(nèi)，并在礦化誘導(dǎo)環(huán)境中加入cyclopamine(5μM)，加載最大形變?yōu)?2%、最小形變?yōu)?的正弦波，頻率為0.1 Hz(5 s拉抻5s放松)張應(yīng)力，

11、對(duì)照組在BioFlex板孔內(nèi)只加入cyclopamine溶劑DMSO(10-2M)，作用24 h，以real-time PCR檢測(cè)張應(yīng)力作用前后，PDLSC成骨相關(guān)標(biāo)志物Runx2、ALP和Hh信號(hào)通路的相關(guān)標(biāo)志物GLI1、PTCH1、SMO在mRNA水平表達(dá)的變化情況。
　　 結(jié)果
　　 1改良法克隆化培養(yǎng)可成功得到PDLSC，其外形為梭形、多角形或不規(guī)則形，體積比牙周膜細(xì)胞稍小，呈漩渦狀、放射狀排列；細(xì)胞具有較高的克

12、隆形成率(13.87%)；PDLSC經(jīng)免疫熒光檢測(cè)波形蛋白陽(yáng)性，角蛋白表達(dá)陰性；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示PDLSC高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO-1(89.9%)和CD146(91.3%)；成骨誘導(dǎo)3周后茜素紅染色陽(yáng)性，有礦化結(jié)節(jié)形成；成脂誘導(dǎo)3周后，可見(jiàn)脂滴形成，油紅O染色陽(yáng)性，說(shuō)明所得細(xì)胞具有多向分化能力：
　　 2 PDLSC經(jīng)FX-4000T加載24h后，其成骨性指標(biāo)Runx2、ALP的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)；同時(shí)Hh

13、信號(hào)通路的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白GLI1、PTCH1、SMO的合成與表達(dá)也增強(qiáng)(P<0.05)，說(shuō)明在PDLSC應(yīng)力成骨的同時(shí)，Hh信號(hào)通路被激活。
　　 3為證實(shí)Hh信號(hào)通路對(duì)PDLSC應(yīng)力成骨的正向調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)以不同濃度的purmorphamine上調(diào)Hh信號(hào)通路活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同濃度purmorphamine刺激下，GLI1、PTCH1、SMO的合成表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，并呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系；同時(shí)，成骨性指標(biāo)Runx2

14、、ALP的合成表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，也呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，首度證實(shí)了Hh信號(hào)通路對(duì)PDLSC應(yīng)力成骨的正向調(diào)控作用。
　　 4為進(jìn)一步證實(shí)Hh信號(hào)通路對(duì)PDLSC應(yīng)力成骨的調(diào)控作用，本研究采用Hh信號(hào)通路抑制劑cyclopamine下調(diào)Hh信號(hào)通路活性，反向證明Hh信號(hào)通路對(duì)PDLSC應(yīng)力成骨的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：加入定量cyclopamine后，PDLSC在應(yīng)力24h后，其GLI1、PTCH1、SMO的合成表達(dá)僅略有增

15、加，同時(shí)成骨性指標(biāo)Runx2、ALP也略有增加，但低于對(duì)照組水平(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1盡管獲取足量的實(shí)驗(yàn)用種子細(xì)胞仍然是我們開(kāi)展PDLSC細(xì)胞應(yīng)力實(shí)驗(yàn)的一個(gè)瓶頸，但是經(jīng)我們改良的克隆化培養(yǎng)法是一種有效的獲取PDLSC的途徑和方法。
　　 2本課題組首度經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)：①在PDLSC應(yīng)力成骨過(guò)程中Hh信號(hào)通路被同步激活；②用興奮劑purmorphamine上調(diào)Hh信號(hào)通路活性后，PDLSC的應(yīng)力成骨作

16、用增強(qiáng)，并且這種增強(qiáng)作用在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性；③在反向下調(diào)Hh信號(hào)通路活性實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用抑制劑cyclopamine后，PDLSC的應(yīng)力成骨作用增加變緩。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證明：Hh信號(hào)通路參與了PDLSC應(yīng)力成骨的調(diào)控過(guò)程。
　　 本課題組在前期研究證實(shí)，動(dòng)態(tài)張應(yīng)力促PDLSC向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，為矯治性牙槽骨應(yīng)力改建的成骨細(xì)胞尋求到了可靠的來(lái)源，為深入探討牙頜畸形的矯治機(jī)理打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本課題是在前期研究基礎(chǔ)上的深入，目的在

17、于探尋PDLSC的應(yīng)力成骨調(diào)控機(jī)制，而隨著PDLSC應(yīng)力成骨調(diào)控機(jī)制研究的深入，必將為正畸臨床的技術(shù)體系革新和治療流程的優(yōu)化提供理論依據(jù)，而且還能從增強(qiáng)成骨性修復(fù)的角度，為增進(jìn)與提高臨床牙周病的治療提供理論依據(jù)。
　　 另外，本實(shí)驗(yàn)所建立的細(xì)胞應(yīng)力實(shí)驗(yàn)研究模式，已經(jīng)證明了Hh信號(hào)通路對(duì)PDLSC應(yīng)力成骨具有直接的調(diào)控作用。誠(chéng)然，PDLSC應(yīng)力成骨的調(diào)控機(jī)制可能涉及多條信號(hào)通路，且不同信號(hào)通路之間還可能有多樣的網(wǎng)絡(luò)狀關(guān)系，因此目前