骨骼肌組織生物力學(xué)和生物化學(xué)時(shí)序性變化推斷死亡時(shí)間的研究.pdf

1、背景與目的：
　　死亡時(shí)間(time of death)也稱死后間隔時(shí)間(Postmortem Interval,PMI)系指尸檢時(shí)距個(gè)體死亡時(shí)的時(shí)間間隔。準(zhǔn)確地推斷PMI，對(duì)于尋找案件偵查線索、鎖定偵查范圍、確定/排除犯罪嫌疑人和案件性質(zhì)，重現(xiàn)作案過(guò)程及審判等方面均有重要證據(jù)價(jià)值。因此，準(zhǔn)確推斷PMI歷來(lái)是法科學(xué)研究與法醫(yī)鑒定實(shí)踐中重要課題之一，也是法醫(yī)學(xué)的歷史性難題。
　　生物力學(xué)已在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，形成了前景廣

2、闊的醫(yī)學(xué)生物力學(xué)。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后的新近學(xué)科，定量地探討病變組織診斷和療效的代謝標(biāo)志物。基于尸體組織“回歸自然”的進(jìn)行性自溶腐敗和風(fēng)化的死后變化，必然存在時(shí)序性生物化學(xué)物質(zhì)降解及其相應(yīng)生物力學(xué)性狀變化的原理，利用生物力學(xué)和代謝組學(xué)的理論和技術(shù)，本課題組前期研究了空氣中和水中大鼠不同PMI的尸體軟組織生物力學(xué)性狀時(shí)序性變化、不同年齡和性別軟組織生物力學(xué)性狀變化，以及放血處死家豬肝、小腸、主動(dòng)脈、皮膚等組織生物力學(xué)和生物

3、化學(xué)性狀時(shí)序性變化規(guī)律，證實(shí)了組織生物力學(xué)性狀、生物化學(xué)指標(biāo)與PMI之間存在明顯的相關(guān)性。
　　本研究系在這些前期研究基礎(chǔ)上，探討甲醛和酒精固定的不同PMI骨骼肌的組織生物力學(xué)性狀，及其固定-萃取液中生物化學(xué)物質(zhì)成分含量變化規(guī)律，結(jié)合骨骼肌組織大體形態(tài)、顯微組織結(jié)構(gòu)和計(jì)算機(jī)病理圖像處理等技術(shù)，量化分析骨骼肌組織生物力學(xué)性狀和生物化學(xué)物質(zhì)變化與組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的構(gòu)效關(guān)系，及其多種量化指標(biāo)分別地和組合地推斷PMI的科學(xué)性和可行性。

4、　　材料與方法：
　　1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織來(lái)源
　　體重120-150 kg成年家豬的骨骼肌組織（里脊肉）組織10批次，保濕儲(chǔ)運(yùn)。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)按生物力學(xué)和生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)需求，處理后分別放入廣口瓶或離心管等特定容器，置于恒溫25℃/恒濕100％人工氣候箱內(nèi)。以家豬死后5 h為第一時(shí)間點(diǎn)，記為0 h。
　　2組織形態(tài)學(xué)觀測(cè)
　　⑴每間隔12 h觀測(cè)大體變化并記錄各時(shí)間點(diǎn)家豬肌肉塊色澤、質(zhì)地、形態(tài)、腐敗程度、氣味等指標(biāo)變化情況。應(yīng)

5、用數(shù)碼相機(jī)和Photoshop CS5.0軟件讀取各時(shí)間點(diǎn)骨骼肌組織照片顏色的RGB值。
　?、圃?-138 h間，每隔12 h，取骨骼肌組織檢材，分別平行和垂直肌肉纖維方向切取，常規(guī)制作組織石蠟切片，分別HE和P-VB特殊染色方法染色，使用Leica Application Suite Version4.0.0圖像分析系統(tǒng)，觀測(cè)記錄各時(shí)間點(diǎn)骨骼肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的時(shí)序性變化情況。采用Image-Pro Plus6.0病理圖像量化分析

6、系統(tǒng)，量化分析骨骼肌組織鏡下肌纖維密度、直徑、面積以及光密度等指標(biāo)。
　　3取材規(guī)范
　　采用“六定”取材規(guī)范：
　?、哦〞r(shí)：生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)組分別于死后0-132 h時(shí)間段內(nèi)每隔12 h取材，共12個(gè)時(shí)間點(diǎn)組。生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)分別于死后0-192 h時(shí)間段內(nèi)每隔12 h取材，共18個(gè)時(shí)間點(diǎn)組；
　?、贫ㄎ缓投ㄏ颍喝〖邑i脊柱肌的背側(cè)肌組部位骨骼肌組織(里脊肉)，平行和垂直肌肉纖維方向切取立方體組織塊；
　　⑶定液和

7、定比：按常規(guī)蒸餾水與分析純甲醛原液按9:1配制4%甲醛溶液，常規(guī)蒸餾水與分析純乙醇原液按2:8配置80%乙醇溶液。生物力學(xué)試件和生物化學(xué)檢材均按檢材與固定液溶劑質(zhì)量-體積比1:10固定，固定時(shí)間為72 h；
　?、榷ㄐ危荷锪W(xué)試件預(yù)取2×2×2 cm3檢材，固定后平整切取1×1×1 cm3正方體試件，生理鹽水沖洗和紗布保濕。生物化學(xué)組以質(zhì)量為準(zhǔn)切相應(yīng)大小立方體狀組織。
　　4生物力學(xué)檢測(cè)
　　每時(shí)間組3-6個(gè)試件，分

8、甲醛固定和乙醇固定兩組，采用便攜式生物力學(xué)檢測(cè)儀(KDI-0.2,凱強(qiáng)利)，沿肌纖維縱向壓縮試件，自動(dòng)監(jiān)測(cè)記錄：力-變形曲線、應(yīng)力-應(yīng)變曲線、極限載荷、平均力、斷裂力、彈性模量、屈服應(yīng)力、屈服應(yīng)變等力學(xué)指標(biāo)。
　　5生物化學(xué)檢測(cè)
　　各時(shí)間點(diǎn)骨骼肌組織固定72 h后，單層快速定性濾紙過(guò)濾（Φ12.5 cm，沃華），分別取甲醛和乙醇的固定-萃取液作為生物化學(xué)檢材：
　　⑴觀察拍照記錄各時(shí)間點(diǎn)固定-萃取液大體顏色變化；

9、r>　?、芃P220型pH計(jì)測(cè)定固定-萃取液的酸堿度；
　　⑶采用鉻鈷比色法測(cè)定固定-萃取液的色度；
　?、溶崛旧ǎ贤?可見(jiàn)分光光度計(jì)（TU-1901，普析通用）全波段掃描，分析固定-萃取液中α-氨基類物質(zhì)濃度變化。
　　6統(tǒng)計(jì)分析
　　采用SPSS16.0、GraphPad Prism5.0和Excel2007等統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各組數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單

10、向方差分析(One-way ANONA)，相關(guān)回歸分析和多元回歸分析，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)的定義P<0.05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差別具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1大體形態(tài)改變
　　新鮮骨骼肌組織色澤隨時(shí)間逐漸變化，呈半透明狀紅色有光澤-暗紅色無(wú)光澤-斑片狀黃色區(qū)-大片金黃色；肌纖維紋理逐漸模糊消失；質(zhì)地由柔韌富彈性逐漸軟化。48 h開(kāi)始出現(xiàn)斑點(diǎn)狀液化，逐漸擴(kuò)大成片狀液化區(qū)，再逐步整體泥化、液化。72-1

11、68 h疏松膨脹，180 h后完全液化，呈稀糊狀。36 h開(kāi)始發(fā)臭，逐漸加強(qiáng)，84 h時(shí)臭味最著，再逐漸減弱，114 h后臭味不明顯。
　　36-120 h的R、G、RGB三者均值隨PMI延長(zhǎng)呈增大趨勢(shì)(p<0.05)，120 h后變化趨勢(shì)不明顯(p>0.05)；B值36小時(shí)后變化趨勢(shì)不明顯。因此，骨骼肌顏色變化推斷PMI的窗口期為36-120 h，各顏色值與PMI相關(guān)回歸方程分別為：PMI=0.884R+75.211， R2=0

12、.9683，PMI=0.8368G+44.383，R2=0.9641；PMI=0.657RGB+55.972，R2=0.9486。多元回歸分析：窗口期為36-120 h，PMI=0.872G-0.589R-0.364B+21.728，R2=0.862。0-36 h各時(shí)間點(diǎn)骨骼肌顏色R、G、B、RGB四通道均值，隨PMI延長(zhǎng)呈減小趨勢(shì)，曲線擬合無(wú)意義（均p>0.05）。
　　2組織形態(tài)學(xué)及病理圖像量化分析
　　HE和P-VB特

13、殊染色觀察，隨著PMI延長(zhǎng)，肌細(xì)胞逐漸腫脹、斷裂、碎裂、溶解、融合；間質(zhì)結(jié)締組織膠原纖維逐漸腫脹、不規(guī)則斷裂、溶解。48 h前，肌纖維間隙較大，之后肌間隙逐漸縮小、纖維逐漸融合；96 h后，肌纖維大片融合；86 h后HE和P-VB染色不均。觀測(cè)各時(shí)間點(diǎn)肌纖維面積、平均密度、平均直徑、累計(jì)光密度。其中縱切面的P-VB染色四個(gè)指標(biāo)變化均呈明顯的時(shí)序性變化規(guī)律，密度窗口期為36-96 h；肌肉纖維面積、直徑、累計(jì)光密度變化趨勢(shì)基本一致，窗口期

14、為72-120 h，均與PMI高度相關(guān)性（P<0.01）。相關(guān)方程為：PMI=0.66X密度-4.312，R2=0.881；PMI=0.236X直徑+4.809， R2=0.853；PMI=1.984×10-3X面積+64.126；R2=0.8527；PMI=（1.146E-6） XIOD+6.310， R2=0.8789。橫切面兩種染色和縱切面HE染色的四種指標(biāo)均無(wú)明顯規(guī)律。
　　3生物力學(xué)性狀檢測(cè)
　　各時(shí)間點(diǎn)試件的極限

15、載荷（最大力）、平均力、彈性模量三個(gè)組織生物力學(xué)性狀參數(shù)較穩(wěn)定，符合總體方差齊性。乙醇和甲醛固定的肌組織生物力學(xué)性狀隨PMI變化趨勢(shì)相同，但乙醇固定的參數(shù)值略大，窗口期內(nèi)各指標(biāo)與PMI相關(guān)性顯著均P<0.05。
　　4生物化學(xué)檢測(cè)
　?、烹SPMI延長(zhǎng)，骨骼肌組織的固定-萃取液顏色逐漸加深，呈無(wú)色透明-淡黃色-深黃色漸變。鉻鈷比色法測(cè)定固定-萃取液的色度值：①乙醇固定-萃取液色度推斷PMI窗口期為12-120 h，間隔36 h

16、組間差異P﹤0.05，PMI=0.32Chroma+1.808，R2=0.826。②甲醛固定-萃取液色度推斷 PMI的窗口期為12-108 h，間隔48 h組間差異 P﹤0.05， PMI=0.28Chroma+1.908，R2=0.895。
　?、埔掖脊潭?萃取液PH值呈無(wú)前平臺(tái)期的上升趨勢(shì)，推斷PMI窗口期為0-84 h，之后變化無(wú)規(guī)律，PMI=4.037PH-23.212，R2=0.922。
　　甲醛固定-萃取液PH均

17、值隨PMI延長(zhǎng)，呈先上升后下降趨勢(shì)，推斷PMI上升窗口期12-48 h和下降窗口期60-120 h。上升窗口期：PMI=3.312PH-11.70，R2=0.837；下降窗口期：PMI=38.061-6.156PH，R2=0.870。
　?、擒崛旧墓潭?萃取液，Abs570nm呈單一穩(wěn)定吸收峰，隨PMI吸光度逐漸增加，呈時(shí)序性上升趨勢(shì)。①乙醇固定-萃取液推斷PMI的窗口期為在48-132 h，間隔36h組間差異性P﹤0.05

18、，PMI=12.860Abs+5.607，R2=0.683。②甲醛固定-萃取液推斷PMI的窗口期為在72-156 h，間隔36h組間差異性P﹤0.05，PMI=12.219Abs+6.395，R2=0.839。
　　結(jié)論：
　　1、基于死后組織自溶腐敗的時(shí)序性變化，骨骼肌組織的單向進(jìn)行性尸體生物化學(xué)降解變化，導(dǎo)致了尸體組織形態(tài)學(xué)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)變化，構(gòu)成了尸體組織生物力學(xué)變化的物質(zhì)基礎(chǔ)，符合基本的物質(zhì)理化構(gòu)效關(guān)系原理，可作為綜合應(yīng)

19、用生物力學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)檢測(cè)相關(guān)的物質(zhì)量變和質(zhì)變的推斷PMI的理論依據(jù)。
　　2、常規(guī)甲醛和乙醇固定的骨骼肌，即時(shí)固化取材時(shí)PMI點(diǎn)的腐敗自溶，同時(shí)，還可提高組織生物力學(xué)性狀的時(shí)間差和延長(zhǎng)其檢測(cè)時(shí)限，提高利用骨骼肌生物力學(xué)性狀推斷PMI的科學(xué)性和實(shí)用性。檢測(cè)極限載荷、平均力、彈性模量等生物力學(xué)相關(guān)指標(biāo)時(shí)序性變化可用于推斷PMI?？傮w上，認(rèn)為甲醛固定組生物力學(xué)推斷PMI優(yōu)于乙醇固定。
　　3、常規(guī)甲醛和乙醇固定骨骼肌，在即時(shí)終

20、止組織自溶腐敗的同時(shí)，還可兼具組織中死后生物化學(xué)變化產(chǎn)物的萃取液作用，檢測(cè)相關(guān)蛋白等生物大分子降解物的種類及其含量變化可以推斷PMI?？傮w上，認(rèn)為乙醇固定組生物化學(xué)推斷PMI優(yōu)于甲醛固定。
　　4、兩種固定-萃取液的PH值、色度值，大體顏色的RGB值，骨骼肌組織形態(tài)體視學(xué)等觀測(cè)指標(biāo)，也可用于推斷PMI，均有各自不同的推斷PMI窗口期和優(yōu)勢(shì)。
　　本項(xiàng)目證實(shí)了綜合進(jìn)行常規(guī)固定后骨骼肌組織生物力學(xué)性狀和生物化學(xué)指標(biāo)以及組織形態(tài)的