家蠶黑化免疫初探.pdf

1、節(jié)肢動(dòng)物的免疫防御完全依賴于先天性免疫，當(dāng)病原物入侵時(shí)，它們只能依靠先天性免疫進(jìn)行廣譜性應(yīng)答。先天性免疫是否發(fā)達(dá)是衡量節(jié)肢動(dòng)物抗病能力強(qiáng)弱的決定性因素。黑色素形成沉積于入侵病原物表面是節(jié)肢動(dòng)物進(jìn)行免疫應(yīng)答的重要表現(xiàn)，在免疫中發(fā)生黑化是節(jié)肢動(dòng)物免疫應(yīng)答唯一可以直接觀察的標(biāo)志。因此，從黑化免疫入手研究昆蟲先天性免疫機(jī)制很早就受到人們的關(guān)注，尤其是在果蠅和蚊子等昆蟲。
　　 家蠶是有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的益蟲，但易遭受多種病原體的侵襲，往往造

2、成生產(chǎn)上的巨大損失。因此，研究揭示家蠶先天免疫機(jī)制對(duì)提高家蠶抗病能力和預(yù)防蠶病的發(fā)生具有重要的理論價(jià)值。同時(shí)，家蠶也是鱗翅目昆蟲重要的分子模型，研究揭示家蠶先天免疫機(jī)制有利于推動(dòng)鱗翅目其它昆蟲的相關(guān)研究，為鱗翅目害蟲的防治提供新的途徑。
　　 目前，關(guān)于家蠶先天性免疫的研究報(bào)道主要集中在抗菌肽、模式識(shí)別蛋白以及信號(hào)通路等方面，而對(duì)于家蠶黑化免疫的報(bào)道卻很少。本文從比較病黑蠶與正常蠶之間基因表達(dá)差異、體外黑化誘導(dǎo)、活體免疫誘導(dǎo)以及

3、相關(guān)物質(zhì)對(duì)細(xì)菌生長的影響等四個(gè)方面來探尋參與家蠶免疫黑化的基因等。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.參與家蠶黑化免疫候選基因的篩選
　　 用熒光定量PCR(qPCR)分析正常熟蠶和同期病黑蠶之間黑色素代謝途徑上基因的表達(dá)量差異，結(jié)果顯示:BmYellow-f、BmTan、BmDat等3個(gè)基因的表達(dá)量在兩種蠶體之間無顯著性差異，BmPAH在病黑蠶中的表達(dá)量下調(diào)了8倍左右，BmTH、BmBlack、BmDDC、BmYellow、

4、BmEbony等基因在病黑蠶中的表達(dá)量與正常熟蠶相比顯著增加(P＜0.001)。
　　 2.體液黑化免疫的體外實(shí)驗(yàn)
　　 用來自真菌（酵母菌）的甘露聚糖，來自革蘭氏陽性菌的肽聚糖(PGN)和來自革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)等3種微生物細(xì)胞壁重要物質(zhì)分子，在體外進(jìn)行誘導(dǎo)家蠶體液的黑化免疫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示:3種物質(zhì)均能誘導(dǎo)家蠶體液發(fā)生黑化，其中脂多糖(LPS)比甘露聚糖和肽聚糖(PGN)誘導(dǎo)家蠶體液發(fā)生黑化的速度更快、程度更

5、強(qiáng)。
　　 用在病黑蠶中明顯上調(diào)表達(dá)的BmDDC基因?qū)?yīng)的DDC蛋白酶的活性抑制劑（卡比多巴），對(duì)能強(qiáng)烈快速誘導(dǎo)家蠶體液發(fā)生黑化的脂多糖(LPS)進(jìn)行黑化抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示:卡比多巴能抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的家蠶體液黑化。這表明家蠶體液黑化免疫確實(shí)需要DDC活性。
　　 3.免疫誘導(dǎo)分析
　　 用大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）和枯草桿菌（革蘭氏陽性菌）注射攻擊家蠶，誘導(dǎo)家蠶免疫應(yīng)答，用半定量RT-PCR分析攻擊后家蠶

6、血細(xì)胞中黑色素代謝相關(guān)基因BmPAH、BmTH、BmDDC、BmYellow、BmEbony、BmTan、BmDat和酚氧化酶基因BmPO1、BmPO-1S、BmPO-2S的表達(dá)變化，結(jié)果顯示:酚氧化酶基因BmPO1表達(dá)有下調(diào)趨勢，BmPO-1S、BmPO-2S表達(dá)與入侵關(guān)系不明顯;黑色素代謝相關(guān)基因BmTH、BmDDC、BmTan表達(dá)量有上調(diào)趨勢，BmPAH、BmDat表達(dá)量有下調(diào)趨勢，這與病黑蠶中表達(dá)情況大體一致;只有在革蘭氏陰性菌

7、入侵時(shí)能檢測到BmYellow短暫的微量表達(dá)，所有樣品中未能檢測到BmEbony表達(dá)。
　　 4.抑菌分析
　　 在培養(yǎng)基中加入phe或tyr，大腸桿菌的生長與對(duì)照組無明顯差異，培養(yǎng)基也沒有明顯變黑表現(xiàn);在培養(yǎng)基中加入dopa或DA，大腸桿菌的菌落形成數(shù)明顯比對(duì)照少，生長明顯受到抑制，培養(yǎng)基也有明顯變黑表現(xiàn)。這說明phe和tyr在空氣中不能衍生成黑色素，沒有或很少對(duì)大腸桿菌有殺滅作用，而dopa和DA在空氣中能衍生成黑色