中華蜜蜂apidaecin基因的克隆及其食品級(jí)表達(dá)初步研究.pdf

1、蜜蜂肽apidaecin是富含脯氨酸的小分子抗菌肽。目前據(jù)報(bào)道apidaecin肽存在14種同種型，分別存在膜翅目8種昆蟲中。迄今未見到有中華蜜蜂(Apisceranacerana)中apidaecin的報(bào)道。已公布的apidaecin前體序列中，成熟肽有重復(fù)單元的現(xiàn)象。 本文通過大腸桿菌(Escherichiacoli)TG1誘導(dǎo)中華蜜蜂成蟲后，液氮研磨提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用已公布的apidaecin成熟肽序列

2、，設(shè)計(jì)出位于成熟肽兩端的簡(jiǎn)并引物，PCR擴(kuò)增出多個(gè)大小依次遞增的DNA條帶。選取分離較清晰的第三條帶，割膠回收轉(zhuǎn)化pMD18-T載體，測(cè)序結(jié)果顯示中華蜜蜂apidaecin成熟肽序列與已公布的意大利蜜蜂(Apismellifera)apidaecin成熟肽序列完全一致，不存在種間差異。 根據(jù)釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的偏嗜密碼子，人工合成apidaecin序列，并通過BamHⅠ和BglⅡ這一對(duì)同尾

3、酶，在pUC18載體中構(gòu)建好apidaecin基因的1-9串體，以期達(dá)到提高表達(dá)產(chǎn)量的目的。從畢赤酵母載體pPICZαA中克隆信號(hào)肽α-factor序列(267bp)至釀酒酵母載體pYES2/CT中，構(gòu)建成分泌型載體。分泌型載體與上述apidaecin多串體連接后，ApaLⅠ單酶切去除Amp+抗性基因大部分片斷，并經(jīng)過Amp+抗性平板的驗(yàn)證，證實(shí)了已經(jīng)失去了Amp+抗性，基本上滿足了食品級(jí)的要求。轉(zhuǎn)化釀酒酵母w303-1a感受態(tài)細(xì)胞，利