高遷移率族蛋白B1在調(diào)節(jié)支氣管哮喘氣道重塑中的作用及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是一種以慢性氣道炎癥、粘液高分泌和氣道高反應(yīng)性為主要特征的全世界發(fā)病率最高的慢性疾病之一，對(duì)全球大約3億患者身體健康造成極大危害。盡管大部分支氣管哮喘病人的病情可以得到有效的控制，但是給全球的社會(huì)、衛(wèi)生健康系統(tǒng)和患者本人賦予了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而盡早的治療氣道重塑被認(rèn)為是一種潛在的能降低哮喘嚴(yán)重程度、提高哮喘控制和預(yù)防改變急性加重的措施，但是目前對(duì)于氣道重塑的發(fā)病機(jī)制仍然不是很清楚。研究已經(jīng)證明炎癥

2、因子在促進(jìn)支氣管哮喘的慢性氣道炎癥和氣道結(jié)構(gòu)慢性改變方面扮演重要的角色。
　　高遷移率族蛋白B1（HMGB1）是一種具有顯著促炎效應(yīng)細(xì)胞因子。
　　高遷移率族蛋白B1在細(xì)胞核內(nèi)作為一種綁定在DNA上的非組蛋白，但它有另外一個(gè)潛在角色:作為內(nèi)源性“危險(xiǎn)信號(hào)分子”，在許多人類疾病中可以啟動(dòng)和擴(kuò)大固有免疫炎癥過(guò)程。大量的來(lái)源于臨床病人和動(dòng)物模型的研究均支持:當(dāng)HMGB1被釋放到細(xì)胞外后可以作為一種重要的促炎癥因子。事實(shí)上HMGB1

3、在許多臨床炎癥狀態(tài)中如膿毒血癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病均表達(dá)顯著升高。最近，我們發(fā)現(xiàn)了HMGB1的表達(dá)水平在支氣管哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者的血漿和誘導(dǎo)痰均異常升高，且HMGB1表達(dá)水平與肺功能若干指數(shù)呈負(fù)相關(guān)，而與中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)正相關(guān)。
　　我們研究還表明HMGB1在OVA誘導(dǎo)的急性哮喘小鼠動(dòng)物模型的肺組織和肺泡灌洗液中均表達(dá)上調(diào)。來(lái)自于shim的研究發(fā)現(xiàn)HMGB1在嗜酸性氣道炎癥過(guò)程中

4、扮演重要角色。更具吸引力研究的是HMGB1還被發(fā)現(xiàn)在肺纖維化過(guò)程中非常重要，HMGB1參與這一過(guò)程部分是通過(guò)降低肺成纖維細(xì)胞增殖和下調(diào)肺泡灌洗液中的白介素1-β來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外一些研究表明HMGB1可以增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的分泌，而動(dòng)物模型上，使用HMGB1抗體拮抗HMGB1活性可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-9活性;而這兩種因子在氣道重塑-這一支氣管哮喘重要病理生理過(guò)程中扮演重要作用。
　　基于以上資料和實(shí)驗(yàn)，我們假設(shè)釋放到氣道中HMGB1

5、在慢性氣道小鼠模型的氣道重塑過(guò)程中扮演重要角色。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，我們檢測(cè)了HMGB1在小鼠肺組織和肺泡灌洗液中的含量，接下來(lái)我們通過(guò)檢測(cè)呼吸動(dòng)力學(xué)、卵清白蛋白-特異性的Ig E，膠原沉積、氣道平滑肌厚度、上皮粘液分泌和炎癥介質(zhì)變化觀察HMGB1對(duì)慢性哮喘小鼠模型氣道重塑的影響。此外我們?cè)隗w外還觀察了HMGB1對(duì)人胎肺成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和膠原合成是否有直接影響，以此闡明部分可能機(jī)制。最后我們還研究了HMGB1和HMGB1/IL-1β

6、復(fù)合物對(duì)于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶-9分泌表達(dá)影響，幫助明確這些因子的細(xì)胞來(lái)源。
　　方法:
　　一、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　1.雌性Balb/c小鼠（每組8只）被隨機(jī)分成磷酸鹽(PBS)對(duì)照組，卵清蛋白蛋白組(OVA)，OVA+同種異型抗體，OVA+抗HMGB1抗體組。小鼠通過(guò)OVA-氫氧化鋁凝膠腹腔注射致敏，繼而用OVA滴鼻反復(fù)激發(fā)6周制作慢性支氣管哮喘模型?？笻MGB1中和抗體在激發(fā)前使用。

7、>　　2.氣道高反應(yīng)性在最后一次激發(fā)24小時(shí)進(jìn)行，使用乙酰膽堿為激發(fā)劑，通過(guò)體積描記法和有創(chuàng)方法兩種方法測(cè)量氣道高反應(yīng)性。
　　3.肺泡灌洗液和肺組織的收集
　　在最后一次激發(fā)后48小時(shí)處死小鼠，PBS灌洗后收集肺泡灌洗液。HE染色法分類計(jì)數(shù)肺泡灌洗液中細(xì)胞。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)肺泡灌洗液中細(xì)胞因子含量。右上肺凍存后用于測(cè)定膠原含量，右肺下葉用于做蛋白免疫印跡(WB)。左肺固定后石蠟包被后行HE染色、免疫組化、馬松三色染色

8、、過(guò)碘酸-雪夫染色。
　　4.膠原含量檢測(cè)
　　根據(jù)膠原蛋白檢測(cè)試劑（Sirius Red Collagen Detection Kit）說(shuō)明書檢測(cè)膠原含量，結(jié)果用膠原微克/克肺表示。
　　5.免疫組化
　　左肺固定后用HE染色評(píng)估肺組織病理改變，然后分別用α-SMA和HMGB1抗體檢測(cè)上述兩種蛋白在肺組織中的表達(dá)。
　　二、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　1.HMGB1對(duì)人胎肺成纖維細(xì)胞MRC-5的體外影響

9、>　　人胎肺成纖維細(xì)胞MRC-5在培養(yǎng)基DMEM中培養(yǎng)
　　1.1 成纖維細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)遷移實(shí)驗(yàn)采用“畫痕實(shí)驗(yàn)”進(jìn)行比較
　　1.2 成纖維細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以DMEM為培養(yǎng)基，在12孔板每孔種入5*104胎肺成纖維細(xì)胞，使用不同濃度的HMGB1刺激MRC-5細(xì)胞1天，2天，3天后，分別用胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞數(shù)量。
　　1.3 采用熒光定量PCR和蛋白印記法分別檢測(cè)α-SMA的表達(dá)
　　2.探討HMGB1和HMGB

10、1/IL-1β復(fù)合物引起那些細(xì)胞的分泌表達(dá)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，基質(zhì)金屬蛋白酶-9
　　2.1 原代培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞
　　原代培養(yǎng)的支氣管上皮細(xì)胞種植于12孔板中，每孔2×105細(xì)胞，然后這些細(xì)胞接受HMGB1和HMGB1/IL-1β復(fù)合物刺激24小時(shí)。
　　2.2 細(xì)胞系的培養(yǎng)和分化
　　細(xì)胞系A(chǔ)549，16-HBE，U937和THP-1均在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。1×106/毫升的

11、THP-1和U937細(xì)胞分別接受佛波酯(PMA)刺激48小時(shí)和72小時(shí)，使得上述細(xì)胞分化成單核/巨噬細(xì)胞亞型。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)，2×105個(gè)上皮細(xì)胞和1×106個(gè)U937和THP-1細(xì)胞種植于12孔板中，分別接受HMGB1，IL-1和HMGB1/IL-1β復(fù)合物的刺激。上述細(xì)胞刺激24小時(shí)候，收集細(xì)胞上清、總RNA、細(xì)胞裂解液行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。
　　2.3 嗜酸性粒細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
　　采用負(fù)性免疫磁珠分離法分離外周血中嗜酸性粒細(xì)

12、胞，采用HE染色檢測(cè)分離嗜酸性粒細(xì)胞純度，至少大于95％，分離成功后，嗜酸性粒細(xì)胞按照每孔5×105個(gè)細(xì)胞種植于24孔板中，然后接受HMGB1和HMGB1/IL-1β復(fù)合物刺激24小時(shí)。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：
　　結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析或者兩分類方差分析分析，組間差異采用Bonferroni法比較， P值＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.HMGB1在慢性哮喘小鼠模型中表達(dá)上

13、調(diào)
　　OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠肺組織和肺泡灌洗液中HMGB1表達(dá)均升高，免疫組化提示HMGB1主要在小鼠肺泡巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞表達(dá)，而HMGB1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞在該模型中顯著增加。
　　2.拮抗HMGB1對(duì)OVA誘導(dǎo)的慢性哮喘小鼠模型氣道重塑影響
　　與慢性哮喘組小鼠比較，拮抗HMGB1組的小鼠的肺泡總細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)明顯下降;OVA哮喘組的氣道高反應(yīng)性明顯增加，而拮抗HMGB1活性后導(dǎo)致小鼠氣道高反應(yīng)性的下降。

14、>　　與OVA誘導(dǎo)慢性哮喘組小鼠比較，接受抗HMGB1抗體注射組小鼠的氣道血管周圍區(qū)域的膠原沉積、PAS-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、氣道周圍平滑肌厚度均顯著下降。
　　類似的，拮抗HMGB1均下降了小鼠外周血OVA-特異性IgE水平和肺泡灌洗液中的IL-1β，IL-4，IL-5，IL-13，TNF-α，VEGF，活性-TGF-β1和總MMP-9表達(dá)水平，免疫蛋白印記法進(jìn)一步證明了:與慢性哮喘組小鼠比較，拮抗HMGB1組小鼠的肺組織的VEGF，總

15、-TGF-β1和MMP-9的蛋白表達(dá)下降。另外，通過(guò)明膠酶譜法證實(shí)，與慢性哮喘組小鼠比較，拮抗HMGB1組小鼠的肺泡灌洗液中MMP-9的活性下降。
　　3.體外HMGB1對(duì)MRC-5細(xì)胞影響
　　濃度為250和1000 ng/mlHMGB1能夠濃度依賴性的增加MRC-5細(xì)胞的遷移能力。另外濃度為250和1000ng/mlHMGB1能夠顯著增加MRC-5細(xì)胞的生長(zhǎng)。以1000 ng/mlHMGB1作時(shí)間依賴性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這種促增

16、殖效應(yīng)在第2天最明顯。另外，濃度為250和1000ng/mlHMGB1能夠增加MRC-5細(xì)胞的α-SMA mRNA的表達(dá)和蛋白表達(dá)。而1000 ng/mlHMGB1能夠提高該細(xì)胞膠原分泌2-3倍。
　　4.HMGB1輕度增加TGF-β1的分泌
　　HMGB1和IL-1β作用于嗜酸性粒細(xì)胞24小時(shí)，僅少量增加該細(xì)胞分泌TGF-β1，在其他細(xì)胞上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)HMGB1和IL-1β能夠增加TGF-β1的分泌。
　　5.HMGB1

17、增加MMP-9表達(dá)和活性
　　0.5 ng/ml IL-1β和250ng/mlHMGB1復(fù)合物以及2 ng/ml IL-1β與1000ng/ml HMGB1復(fù)合物能夠顯著增加16-HBE細(xì)胞，PBECs，A549 cells和中性粒細(xì)胞的MMP-9細(xì)胞的分泌。
　　6.HMGB1增加VEGF的表達(dá)和分泌
　　HMGB1/IL-1β復(fù)合物可以增加16-HBE細(xì)胞，原代培養(yǎng)支氣管上皮細(xì)胞，A549細(xì)胞，未分化U937 ce